艾灸預處理對過度訓練致心肌損傷大鼠血漿SOD/MDA、NOS和心肌COL的影響*

★ 熊英 奚人杰 孔士琛 楊曉媛 (南京中醫藥大學第二臨床醫學院 南京210023)

“治未病”是指采用一定的方法，通過增強機體的抗病與應激能力，達到防治疾病或保健的目的。艾灸是中醫學“治未病”的常用手段之一，早在古代文獻中就有大量艾灸防治心血管疾病的記載。在競爭日益激烈的競技體育運動中，急性力竭運動或長期大強度運動等超負荷訓練是必不可少的，但超負荷訓練的運動量常導致心肌的損傷［1］。本課題組的前期實驗研究已證實艾灸預處理對急性力竭運動性心肌損傷有一定的防治作用，但艾灸預處理對于長期過度訓練導致的心肌損傷有無保護作用及相關機制還不清楚。

鑒于以往的研究結果，本研究在大鼠過度游泳訓練模型的基礎上，運用艾灸預處理進行干預，觀察艾灸預處理對過度訓練大鼠心肌損傷的保護作用及其對機體抗氧化能力、一氧化氮合酶的影響，為闡明艾灸預處理的心肌保護作用和機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選用SPF級健康雄性SD大鼠36只，體重180～210g。大鼠常規分籠飼養，一組2籠，均以標準嚙齒類動物飼料飼養，自由飲食。室溫保持在20℃～22℃，相對濕度50～60%，光照時間為12h/d。大鼠參照隨機數字表分為4組，包括正常對照組(C組，n=9)、一般訓練組(E組，n=9)、過度訓練組(OE組，n=8)和過度訓練+艾灸組(OEM組，n=10)。

1.2 過度訓練模型的建立［2］大鼠進行為期六周的遞增負荷的過度游泳訓練。先適應性喂養3d，然后適應性游泳3d。第1周進行不負重游泳30min。從第2周起每日游泳30min，負3%體重。第3周起游泳時間每日增加10min，直到60min，負4%體重。第4周每天游泳60min，負5%體重。第5周、第6周每天游泳60min，負6%體重。在整個訓練期間，客觀條件始終保持相同。每周訓練6d，每天訓練1次，水溫32℃±2℃，室溫保持在20℃～22℃，相對濕度50%～60%。在大鼠游泳的過程中，如發現力竭表現(鼻孔沒入水面以下5～10s不能主動上浮)，便撈出水面休息5min后，繼續游滿規定時間。

1.3 分組 所有大鼠進入動物房后，先適應性喂養3d。E組、OE和OEM組大鼠先進行3d的適應性游泳;實驗結束時，各組在同一時間麻醉取材。

C組:大鼠常規喂養，不游泳。

E組:大鼠常規喂養的同時，進行為期6周的中等強度的游泳訓練，游泳時間從第1天30min逐日增加10～60min后，便不再增加，以后每日游泳訓練60min(不負重)。

OE組:大鼠常規喂養的同時，進行遞增負荷的過度游泳訓練。

OEM組:訓練方案同OE組，但每次在游泳后進行艾灸預處理，所取穴位為腎俞、后三里穴，取穴參照《實驗針灸學》(李忠仁主編，中國中醫藥出版社，2003年出版)，使用自制麥粒灸艾炷，每次艾灸一側的穴位，每穴5壯。

大鼠在游泳后，迅速用干毛巾擦干水分，電吹風吹干后，或放回籠中休息，或立即進行艾灸。

1.4 取材和標本制備 將大鼠用0.4%戊巴比妥鈉(1mL/100g體重)腹腔注射麻醉后，呈仰臥位固定，打開腹腔，先從腹主動脈抽取4mL的血，用抗凝管裝取待檢測;而后打開胸腔，暴露心臟，取出心臟，一部分整心放入4%多聚甲醛中固定待測;另一部分取心室部分，用生理鹽水漂洗干凈，-80℃保存。

1.5 觀察指標

1.5.1 心臟組織形態學觀察 稱取大鼠體重、心重，計算心臟重量指數。

光鏡觀察:取心肌組織，在4%多聚甲醛溶液中固定1周后，常規脫水、透明、浸蠟和包埋，切片后蘇木素-伊紅染色(HE染色)，在光學顯微鏡下觀察心肌變化。

1.5.2 血漿生化檢測 采集外周血標本并置于EDTA管抗凝，離心分離血漿，應用相關試劑盒(試劑盒由南京建成生物工程研究所提供)分別測定血漿中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)的含量，操作規程嚴格按照說明書進行。

1.5.3 Elisa測定 采集外周血標本并置于EDTA管抗凝，離心分離血漿，應用相關測定試劑盒(試劑盒由南京建成生物工程研究所提供)測定內皮型一氧化氮合酶(eNOS)含量。

準確稱取心肌組織重量，按重量體積比加入9倍的生理鹽水制成10%的組織勻漿，2 500轉/分，離心10min，取上清40μL待測，按照試劑藥盒及說明測定心肌膠原(COL)含量。

1.6 數據處理 實驗數據采用SPSS11.5軟件處理，所有數據均用平均數±標準差(ˉx±s)表示，各組采用單因素方差分析(ANOVA)，多個樣本均數兩兩比較用LSD檢驗，方差不齊用Dunnett’T3進行檢驗，以P＜0.05為顯著性差異。

2 結果

2.1 心重、體重及心臟重量指數的改變 如表1所示，各組訓練前的體重無顯著差異。經過6周的游泳訓練，各組大鼠心臟絕對重量無顯著差異，但各訓練組大鼠體重均顯著低于C組(P＜0.01)，OE組大鼠體重顯著低于E組(P＜0.05)。各訓練組大鼠心臟重量指數顯著增加，與C組比較有顯著差異(P＜0.01)。雖然OE組和OEM組的心臟重量指數大于E組，但并無顯著差異。

2.2 HE染色觀察 如圖1所示，C組大鼠心肌纖維排列整齊勻稱，毛細血管微動靜脈形態正常;E組大鼠心肌纖維排列整齊勻稱，毛細血管微動靜脈形態正常;而OE組大鼠心肌纖維腫脹，排列紊亂，部分斷裂及局灶狀壞死，小血管瘀血較嚴重;OEM組大鼠心肌纖維也有腫脹，排列紊亂程度比過度訓練組要輕，未見斷裂，瘀血不嚴重。

2.3 血漿SOD、MDA含量比較 見表2。與C組比較，其余三組的SOD活力值并無明顯差異;但與E組比較，OE組的SOD活力值明顯下降(P＜0.01);與OE組比較，OEM組的SOD活力值明顯升高(P＜0.05)。

與C組比較，OE組的MDA值明顯升高(P＜0.05);與E組比較，OE組和OEM組的MDA值明顯升高(P＜0.01，P＜0.05);與OE組比較，OEM組的MDA值明顯降低(P＜0.05)。

與C組比較，OE組的SOD/MDA值明顯降低(P＜0.05);與E組比較，OE組和OEM組的SOD/MDA值明顯降低(P＜0.01，P＜0.05);與OE組比較，OE組的SOD/MDA值明顯升高(P＜0.05)。

2.4 血漿NO含量和iNOS、eNOS活力值比較 見表3。與C組比較，OE組的NO值明顯下降(P＜0.05)。與C組和E組比較，OE組的iNOS活力值均有明顯上升(P＜0.01，P＜0.05);與OE組比較，OEM組的iNOS活力值有明顯下降(P＜0.05)。

表1 各組體重、心重及心臟重量指數的改變

圖1 各組HE染色觀察(40X)

表2 各組SOD及MDA值比較

表3 各組NO含量以及iNOS、eNOS活力值比較

表4 各組心肌COL含量的比較

與C組比較，其余三組的eNOS活力值具有顯著升高(P＜0.01);與E組和OE組比較，OEM組的eNOS活力值均明顯升高(P＜0.05，P＜0.05)。

2.5 心肌組織COL含量的比較 見表4。與C組比較，其余三組在心肌COL含量上具有顯著升高(P＜0.05，P＜0.01);與E組比較，OE組的COL含量有明顯升高(P＜0.01);與OE組比較，OEM組的COL含量有明顯下降(P＜0.05)。

3 討論

3.1 過度訓練對心肌的損傷 適度的運動訓練可使心臟產生良好的適應性改變，即運動心臟，表現為特有的高功能、高儲備、大心臟，這是心臟生理代償變化的結果，這些變化能增強心臟功能，提高運動能力。但過度訓練可導致心肌損傷［3］。長時間大強度的運動可導致運動性疲勞和運動性心肌損傷的發生，心肌出現脂質過氧化加強、Ca2+超載等現象，由于Ca2+超載是心肌缺血/再灌注(I/R)損傷的重要機制之一，其改變與運動后心肌損傷的時相性變化一致，與臨床上I/R損傷的特點相似，故這種心肌損傷又稱為運動性I/R損傷［1］。近年來，大量的資料也證實氧化應激與心肌纖維化的形成密切相關。氧自由基可激活基質金屬蛋白酶，分解膠原蛋白，從而破壞正常的細胞外環境，導致各種生長因子的表達，引起心肌膠原重建，間質重塑，從而促進心肌纖維化。而心肌纖維化時膠原組織緊密包繞正常心肌，可以致使心肌細胞慢性缺氧，加速心肌細胞結構和功能的破壞［4］。

本研究顯示，一般訓練可以使心肌適應性增大，但并無膠原的增生、心肌的纖維化;機體的氧自由基代謝正常，抗氧化防御系統功能得到加強。但過度訓練會導致機體的氧自由基大大增加，使機體的抗氧化防御系統功能受到影響，使心肌的結構和功能受到破壞，心臟由生理代償逐漸轉變為病理性的肥大，同時膠原增生、心肌開始出現纖維化。

3.2 艾灸預處理對過度訓練所致心肌損傷的保護作用 本課題組在前期的研究中發現，艾灸對急性力竭性運動所致的心肌損傷有一定的保護作用。在本研究的結果顯示，艾灸預處理對于長期過度訓練所致的心肌損傷也具有一定的保護作用，心肌的充血程度和心肌纖維的斷裂均有所減輕，心肌纖維化的程度也明顯減輕。

3.3 艾灸預處理的心肌保護機制 NO半衰期極短(僅數秒)，不易直接測定，故常通過檢測一氧化氮合成酶(NOS)來間接反映NO的代謝情況［5］。心肌組織內的NOS主要有兩種亞型:eNOS和iNOS，eNOS主要存在于血管內皮細胞，由eNOS催化生成的內皮源性NO是介導內皮依賴性舒張功能的主要介質，其主要以彌散的方式進入血管平滑肌和血流，可舒張所有類型的血管，所以在組織血管的I/R中發揮著重要的作用。iNOS在受到刺激后由炎癥細胞大量表達，其催化生成的NO可以與氧立即反應，生成如過氧化亞硝酸鹽(ONOO-)等氧自由基，從而介導心肌的I/R損傷及內皮功能失調。

MDA是細胞膜磷脂膜受到氧化損傷時的產物，其含量升高說明體內過氧化反應比較劇烈。而SOD是體內清除超氧化物陰離子轉移性的酶，自由基濃度的升高可造成SOD活性的降低［6］。

本研究表明，艾灸預處理能增強血管內皮eNOS的活力，改善血管內皮功能，體內的氧化應激反應程度也有所減輕，從而使過度訓練所致的I/R損傷有所減輕。同時，艾灸預處理能一定程度抑制iNOS的活力，減少對心肌的損傷，這可能與艾灸減輕了機體的氧化應激反應，使心肌損傷減輕有關。另外，艾灸使機體SOD的活力有所提高，另一方面使機體內的SOD消耗減少，從而一定程度地糾正了機體的抗氧化防御系統功能的紊亂，心肌纖維化也有所減輕。

4 總結

一般訓練能使心肌產生良好的適應性表現，心臟可生理性增大，心臟功能提高，體內的氧化防御系統功能良好。但過度訓練會抑制eNOS的活力，影響內皮依賴性血管舒張功能，機體抗氧化防御系統功能紊亂，使心肌出現損傷，并有一定程度的纖維化和病理性的增大。艾灸預處理可以增強eNOS的活力，降低iNOS的活力，使血管內皮功能提高，減輕機體的氧自由基損傷，使機體的氧化防御系統功能有一定的改善，從而能一定程度地減少心肌損傷，減少心肌纖維化，對過度訓練所致的心肌損傷有一定的保護作用。

［1］王瑩，常蕓.力竭運動后不同時相大鼠心肌核呼吸因子1的變化［J］.中國運動醫學雜志，2008，27(4):458-462.

［2］李雪，袁瓊嘉，熊若虹.不同負荷運動對大鼠大腦皮質超微結構的影響［J］.成都體育學院學報，2006，32(3):111-113.

［3］吳廣禮，容俊芳，溫進坤.近年來過度訓練致臟器損傷的研究概況［J］.解放軍醫學雜志，2006，31(3):267-269.

［4］Sorescu D，Griendling KK.Reactive oxygen species，mitochondria，and NAD(P)H oxidases in the developmentand progression of heart failure［J］.Congest Heart Fail，2002，8(3):132.

［5］Sun HY，Xue FS，Xu YC，etal.Propofol improves cardiac functional recovery after ischemia-reperfusion by upregulating nitric oxide synthase activity in the isolated rat hearts［J］.Chin Med J(Engl)，2009，122(24):3 048-3 054.

［6］邊云飛，秦衛偉，宋曉蘇，等.硫化氫對氧應激所致心肌細胞損傷的影響及機制［J］.中國動脈硬化雜志2011，19(4):310-314.