小花棘豆中毒對家兔腦組織α-甘露糖苷酶的影響

賈琦珍 王 帥 張 玲 郭 武 陳根元

(1 塔里木大學生命科學學院， 新疆 阿拉爾 843300)(2 新疆生產建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室， 新疆 阿拉爾 843300)(3 塔里木大學動物科學學院， 新疆 阿拉爾 843300)

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小花棘豆中毒對家兔腦組織α-甘露糖苷酶的影響

賈琦珍1,2王 帥2,3張 玲2,3郭 武3陳根元2*

(1 塔里木大學生命科學學院， 新疆 阿拉爾 843300)(2 新疆生產建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室， 新疆 阿拉爾 843300)(3 塔里木大學動物科學學院， 新疆 阿拉爾 843300)

探討小花棘豆對家兔腦組織α-甘露糖苷酶(AMA)的影響，進一步揭示小花棘豆的毒性作用機理。將24只家兔隨機分為4組，即對照組和試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組。將小花棘豆全草粉碎后，按試驗Ⅰ組添加15%，試驗Ⅱ組添加30%，試驗Ⅲ組添加45%的比例制作混合飼料，飼喂至典型臨床癥狀出現為止。攻毒后第14、35、70d每次每組隨機采集2只家兔的全腦，檢測家兔不同腦區AMA活性及表達的變化。結果顯示，小花棘豆中毒可不同程度地導致家兔腦組織AMA活性和表達下降，從第14d起，所有試驗組小腦AMA活性及mRNA表達量均顯著低于對照組(P﹤0.05)，試驗Ⅲ組家兔大腦和丘腦AMA活性及mRNA表達量均顯著低于對照組(P﹤0. 05)，但3個試驗組海馬和腦干AMA活性及mRNA表達量與對照差異均不顯著(P﹥0. 05)。結果表明，不同劑量小花棘豆均可降低家兔腦組織AMA活性及其mRNA表達量，小腦、大腦和丘腦是其主要作用的靶區，而且小腦的變化較大腦和丘腦明顯。

小花棘豆；α-甘露糖苷酶； 中毒； 家兔

小花棘豆(OxytropisglabraDC)廣泛分布于新疆和田、阿克蘇等地區，據不完全統計，僅阿克蘇地區的271.97萬hm2天然草場中廣泛叢生小花棘豆的面積已超過40萬hm2，每年因采食小花棘豆而中毒的家畜占放牧家畜總數的5%～10%，中毒動物表現為機體的廣泛性損傷，其中尤以神經系統損傷最為明顯[1]。小花棘豆具有根系發達，繁殖系數高，耐旱，耐貧瘠，返青早，多種籽，生命力強等特性，現已嚴重危害新疆草原畜牧業的發展[2]。針對于此，課題組成員對動物小花棘豆中毒的病理學等進行了研究，發現小花棘豆中毒可導致動物抗氧化機能[3，4]，血液生理生化指標[5-7]等異常變化。研究表明α-甘露糖苷酶(AMA)是動物小花棘豆中毒特異性最強的指標[8]，小花棘豆中毒動物的AMA活性受到顯著抑制，但對其轉錄、翻譯、加工修飾等的影響尚不清楚。本試驗通過ELISA和熒光實時定量PCR法，以新疆南疆地區小花棘豆為毒源，研究小花棘豆攻毒對家兔腦組織AMA活性和mRNA表達量的影響，為小花棘豆中毒機制的研究提供基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料、試劑與儀器

小花棘豆由塔里木大學動物科學學院草業科學學科組提供，采自新疆和田市策勒縣恰哈鄉，樣品為風干樣。

AMA檢測試劑盒，南京建成生物技術有限公司；總RNA提取試劑Trizol，反轉錄試劑盒，PCR擴增試劑盒Hot-startPCRMix，實時熒光定量PCR試劑盒SYBRGreenIPCRMix，均為美國Thermo；其余試劑均為國產分析純，實驗室用水為超純水。

PCR儀(Eppendorf公司5331)，電泳儀(北京六一DYY-Ⅱ)，組織勻漿儀(ProScientific公司PRO250)，凝膠成像分析儀(UVP公司GELDOC-IT)，實時熒光定量PCR儀(Eppendorf公司Realplex2)，紫外-可見分光光度計(Varian公司Carry100)。

1.2 試驗動物分組與處理

家兔24只，雌雄各半，體重(2.0±0.1kg)，購自塔里木大學動物科學學院實驗站。隨機分為對照組，試驗Ⅰ組、試驗Ⅱ組和試驗Ⅲ組，每組6只。分籠飼養，自由采食和飲水。對照組飼喂青干草，試驗Ⅰ組、試驗Ⅱ組和試驗Ⅲ組分別飼喂含有小花棘豆15%、30%和45%的混合干草。試驗持續70d。在攻毒后第14、35和70d每組隨機取2只家兔，剖殺后取全腦組織，在冰面上迅速分取雙側大腦皮層、小腦、丘腦、腦干和海馬，部分置于0.32mol/L蔗糖緩沖液(1/10，W/V)中勻漿10min，2 500r/min離心15min后制備10%組織勻漿液用于檢測AMA活性，AMA活性檢測采用間接ELISA法；部分組織液氮保存用于檢測mRNA水平表達的影響。所有解剖工具及凍存管均預先用DEPC水處理。

1.3 小花棘豆中毒家兔腦組織AMA在mRNA表達水平的測定

1.3.1 引物設計與合成

根據GenBank中家兔AMA及β-actin基因的核苷酸序列，采用BeaconDesigner軟件設計引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物信息表見表1。

1.3.2 總RNA提取與cDNA合成

根據Trizol法操作方法提取家兔不同腦組織總RNA，然后用核酸蛋白檢測儀測定其OD260和RNA濃度，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。確認提取的RNA合格后采用反轉錄試劑盒進行反轉錄反應。反轉錄反應體系見表2。其反應程序為：95 ℃預變性3min， 94 ℃變性30s，55 ℃退火30s，72 ℃延伸30s，反應40個循環，72 ℃最終延伸10min。

表1 引物設計

表2 反轉錄反應體系

1.3.3 普通PCR及基因測序

PCR反應體系見表3。其反應程序為：95 ℃預變性5min， 94 ℃變性20s，58 ℃退火30s，72 ℃延伸30s，反應30個循環，72 ℃最終延伸10min[7]。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.3.4 實時熒光定量PCR檢測家兔腦組織中AMA的相對表達

實時熒光定量PCR反應體系見表4。其反應程序為：95 ℃預變性3min， 94 ℃變性30s，58 ℃退火30s，72 ℃延伸30s，反應35～40個循環，72 ℃最終延伸10min。

1.4 數據分析

試驗數據使用SPSS16.0軟件中One-WayANOVA方法進行單因素方差分析。

表3 PCR反應體系

表4 實時熒光定量PCR反應體系

2 結果與分析

2.1 引物的可靠性驗證

由圖1可知，β-actin在200bp下方出現175bp左右的條帶，AMA基因在300bp下方出現258bp左右的條帶，與試驗設計的目的條帶大小相符，表明引物設計良好。

圖1 引物PCR電泳圖

2.2 家兔不同腦區AMA活性的變化

由表5可知，攻毒第14d時各試驗組家兔小腦AMA活性與對照組差異均顯著低于對照組(P﹤0.05)；試驗Ⅲ組家兔大腦和丘腦AMA活性均顯著低于對照組(P﹤0.05)，但試驗Ⅰ組和試驗Ⅱ組大腦和丘腦AMA活性與對照家兔差異不顯著(P﹥0.05)。各試驗組家兔臨床表現為被毛失去光澤，但均未見典型中毒癥狀。攻毒第35d時各試驗組家兔小腦AMA活性均極顯著低于對照組(P﹤0.01)；試驗Ⅰ組家兔大腦和丘腦AMA活性顯著低于對照(P<0.05)，試驗Ⅱ組和試驗Ⅲ組家兔大腦和丘腦AMA活性均極顯著低于對照組(P﹤0.01)，期間攻毒家兔出現行動困難、喜臥等癥狀，其中試驗Ⅲ組尤為明顯。攻毒第70d時所有試驗組家兔小腦和丘腦AMA活性均極顯著低于對照組(P﹤0.01)，除試驗Ⅰ組外其余試驗組大腦AMA活性均極顯著低于對照組(P﹤0.01)。中毒家兔頭部出現神經性震顫，對外界反應遲鈍，運動協調性下降，試驗Ⅲ組家兔出現死亡。但整個試驗期內所有試驗家兔海馬和腦干AMA活性差異不顯著(P﹥0.05)。

2.3 家兔小花棘豆中毒對AMA在mRNA水平表達的影響

由表6可知，AMAmRNA在不同腦組織間表達差異不同。與對照組相比，第14d時試驗Ⅰ組、試驗Ⅱ組和試驗Ⅲ組家兔小腦中AMAmRNA表達量分別下降了34.8%、38.8%和44.9%，均與對照組差異顯著(P﹤0.05)；試驗Ⅰ組和試驗Ⅱ組大腦、丘腦中AMAmRNA表達量均呈下降趨勢，但與對照組差異不顯著(P﹥0.05)，試驗Ⅲ組家兔大腦、丘腦中AMAmRNA表達量與對照相比分別下降了40.6%和44.4%，與對照組差異顯著(P﹤0.05)。第35d時各試驗組家兔小腦AMAmRNA表達量與對照相比分別下降了40.3%、52.5%和65.2%，其中試驗Ⅱ組和試驗Ⅲ組均極顯著低于對照組(P﹤0.01)；試驗Ⅰ組家兔大腦和丘腦AMAmRNA表達量顯著低于對照(P<0.05)，試驗Ⅱ組和試驗Ⅲ組家兔大腦和丘腦AMAmRNA表達量均極顯著低于對照組(P﹤0.01)。攻毒第70d時所有試驗組家兔小腦和丘腦AMAmRNA表達量均極顯著低于對照組(P﹤0.01)。但整個試驗期內所有試驗家兔海馬和腦干AMAmRNA表達量未見明顯變化。表明小花棘豆中毒可抑制家兔大腦、小腦及丘腦中AMA在mRNA水平的表達，并呈現出明顯的時間-劑量效應。小花棘豆毒性成分作用的主要靶區為小腦、丘腦和大腦。

3 討論

苦馬豆素是小花棘豆的主要毒性成分，學名為1,2,8-三羥基八氫吲哚里西啶，其半椅狀結構與甘露糖類似，可強烈的、特異性的與AMA結合，從而使機體甘露糖代謝發生異常，導致甘露糖大量蓄積于細胞內而造成細胞空泡變性，最終導致細胞損傷[9]。AMA在機體糖蛋白合成和代謝方面具有重要的作用，細胞中蛋白質合成后需要經過加工、修飾后方可發揮生物活性。AMA在N-糖基化過程中對甘露糖進行加工，該過程與蛋白的折疊、運輸、成熟、構象維持、半衰期及生物活性密切相關。AMA既是N-聚糖成熟的必要酶，也參與N-聚糖的降解[10，11]。試驗表明，小花棘豆中毒家兔大腦、小腦和丘腦等部位AMA活性顯著下降，其結果與榮杰[12]的報道一致，證明小花棘豆毒性成分可通過影響AMA導致動物中毒。

表5 家兔試驗期內不同腦區AMA活性的變化(nmol·S-1·L-1)

注：同列數據小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)，大寫字母不同表示差異極顯著(P<0.01)，下同。

表6 AMA mRNA在家兔不同腦區相對表達情況

小花棘豆中毒可導致動物細胞空泡變性，鏡檢可見中毒動物大腦出現普遍性神經元腫脹，小腦萎縮，蒲肯野細胞和顆粒細胞喪失[1]，表明小花棘豆中毒可顯著影響動物神經系統。前期研究表明小花棘豆中毒可抑制AMA活性，但對其轉錄、翻譯、加工修飾等的影響研究較少。張建軍等[13]研究發現小花棘豆中毒可顯著影響小鼠肝臟組織內AMA的相對表達，其中高劑量組可顯著降低肝臟組織內的AMA基因相對表達。本試驗研究發現，小花棘豆毒性成分可顯著影響小腦、大腦及丘腦的AMA在mRNA水平的表達，表明小花棘豆毒性成分可從mRNA水平影響AMA的表達，從而為揭示小花棘豆中毒的作用機理奠定了基礎。

AMA活性受到抑制可導致細胞內糖蛋白的N-糖基化合成、加工、轉運等過程發生變化，臨床上表現為生殖功能、內分泌和免疫功能紊亂[14，15]。試驗表明AMA在不同腦區活性與表達水平差異顯著，其中小腦、大腦和丘腦的表達水平顯著高于海馬、腦干，小花棘豆中毒對AMA的抑制作用也主要作用于小腦、大腦和丘腦。從本試驗結果來看，小花棘豆中毒可導致家兔大腦、小腦及丘腦AMA活性與表達水平顯著下降，而且下降趨勢與小花棘豆攝入量呈現極顯著的正相關。這種變化趨勢與家兔行為學變化之間也呈現出明顯的對應性。綜上可以得出上述三部分腦區可能是小花棘豆毒性物質的作用靶區。

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OxytropisglabraDCPoisoningEffectsonα-mannosidaseinRabbitBrain

Jia Qizhen1,2Wang Shuai2,3Zhang Ling2,3Guo Wu3Chen Genyuan2 *

(1 College of Life Science, Tarim University, Alar, XinJiang 843300)

(2 Key laboratory of Tarim Animal Husbandry Science and Technology, XinJiang Production & Construction Corps, Alar, XinJiang 843300)

(3 College of Animal Science, Tarim University, Alar, XinJiang 843300)

To studyOxytropisglabraDConrabbitbraintissueα-mannosidase(AMA)effect,andfurtherrevealthemechanismofthetoxicityofO.glabraDC,24rabbitswererandomlyandequallydividedinto4groups(thecontrolgroupandexperimentalgroupⅠ,Ⅱ,Ⅲ).ThedriedplantofO.glabraDCwascomminnuted,anddifferentamountsofthegrasspowder(15%,30%and45%)weremixedwiththefeedsinthethreeexperimentalgroups.Therabbitsconsumedtheforagesfreelyuntiltypicalsymptomswereobserved. 2rabbitswereselectedrandomlyfromeachgrouponthe14th, 35thand70thdayrespectively,thebrainwascollectedandthecontentsofAMAanditsmRNAexpressionindifferentencephalicregionsweremeasured.TheresultsdemonstratedthatO.glabraDCinhibitedthecontentandexpressionofAMA,thecontentofAMAandtheexpressionofAMAmRNAincerebelluminallexperimentalgroupsweresignificantlylowerthannormalcontrolgroupfrom14thday(P﹤0.05),thecontentofAMAandtheexpressionofAMAmRNAincerebrumandthalamusinexperimentalgroupⅢweresignificantlylowerthannormalcontrolgroup(P﹤0. 05),butthedifferenceofthecontentofAMAandtheexpressionofAMAmRNAwerenotobviousinbrainstemandhippocampus(P﹥0. 05).TheresultsshowedthatO.glabraDChasremarkableeffectsonthecontentsofAMAofbraininrabbits.ItisindicatedthatthreeregionsweretheeffecttargetsitesofO.glabraDCinthebraintissue,weconcludedthatO.glabraDCcouldproducepoisoningeffectbypromotingcerebellum,cerebrumandthalamus.

OxytropisglabraDC;α-mannosidase;poisoning;rabbit

2014-06-03

新疆生產建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室開放課題(HS201409)

賈琦珍(1984-)，女，碩士，研究方向為動物中毒病。E-mail:xiaxue1984521@126.com

*為通訊作者E-mail:cgygood207@163.com。

1009-0568(2014)01-0018-06

S

ADOI：10.3969/j.issn.1009-0568.2015.01.003