腦爾康及其拆方組對AD模型小鼠腦內SYN、RAGE水平表達的影響＊

侯吉星 陳良梅 馬新欣 李 璽△ 張露瑩 西安市精神衛生中心（西安710061）

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是老年期常見的一種中樞神經系統退行性病變，前期的研究證實，腦爾康對AD模型小鼠學習記憶障礙有明顯的保護和改善作用，并初步探討了該方改善認知的作用機理［1－4］。本實驗通過構建AD模型小鼠，觀察復方中藥腦爾康及其拆方對慢性鋁中毒AD模型小鼠學習記憶障礙的改善作用及對小鼠皮層、海馬中突觸素（Synaptophysin，SYN），高級糖基化終產物受體（Receptor for advanced gyration end products，RAGE）的影響，旨在探討中藥抗癡呆的作用機制，篩選出藥味精簡，療效相當的組方，為進一步新藥開發精練處方提供實驗依據。

1 材 料 1.1 動 物 健康雄性昆明種小鼠70只，體質量30±2.8g，由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（陜）12－004號。

1.2 藥物與試劑 中藥腦爾康膠囊為院內制劑（陜衛藥制劑注字920138），全方由人參、黃芪、川芎、丹參、益智仁、生地、菖蒲、冰片等組成。由西安交通大學醫學院第二附屬醫院藥房提供。結晶三氯化鋁（分析純，AlCl3·6H2O，相對分子質量241.43，天津市津北精細化工有限公司產品，批號111123）；抗SYN抗體（武漢博士德生物工程有限公司產品，批號120815）；SABC免疫組化試劑盒（北京博奧森生物工程有限公司產品，批號120713）；抗RAGE抗體（北京博奧森生物工程有限公司產品，批號120602）。

1.3 主要儀器 跳臺儀（西安交通大學醫學院動物實驗中心提供），臺式離心機（上海夏普電器有限公司產品，型號：WP850A），石蠟切片機（日本PIKA SEIA公司，型號：RM－2245），低溫冰箱（日本SANYO公司，醫用冰箱500型），圖像信號采集與分析系統（德國Leica公司 型號：Qwin550CW）。

2 方 法 2.1 藥品、工作液制備 腦爾康濃縮液全方組：人參、川芎、丹參、益智仁、菖蒲各23g，冰片2.3g，熟地、首烏各35g，黃芪70g。按傳統方法水煎，濃縮至257mL，使成每毫升含生藥1g·mL－1，各拆方組生藥量同原方，煎法相同。拆方1號組：人參、川芎各23g，熟地35g，冰片2.3g；拆方2號組：黃芪70g，首烏35g，丹參、菖蒲各23g；拆方3號組：人參、丹參各23g，首烏35g，冰片2.3g；拆方4號組：人參、丹參、益智仁各23g，冰片2.3g。水煎后均濃縮至257mL，使各拆方組合中生藥濃度與全方中各相應生藥濃度相同，115℃ 高壓滅菌20min，備用；結晶三氯化鋁固體粉末溶于雙蒸水，配制濃度為10g·L－1，0.25μm雙層超濾膜過濾，待用。

2.2 分組及模型的建立 采用隨機數字法將實驗小鼠隨機分為7組，每組10只，按文獻［5］，除空白組外，各組小鼠以AlCl3溶液100mg·kg－1，灌胃，隔日1次，共40d，造成慢性鋁中毒AD模型；空白對照組用生理鹽水0.2mL灌胃，隔日1次，共40d。

2.3 學習記憶成績測試 最后一次腹腔AlCl3灌胃30 min后，將小鼠放置于跳臺儀中，適應跳臺環境3min，然后將小鼠輕放于平臺上，當小鼠從跳臺上跳下，接觸跳臺銅柵時，立即給予25V電壓刺激，記錄小鼠逃避至平臺上的時間（潛伏期），并記錄3min內的觸電次數（錯誤次數），以此作為學習成績。24h后進行測試，將小鼠置于平臺上，記錄其第一次跳下受電擊的時間（潛伏期）及3min內受電擊的次數（錯誤次數），以此作為記憶成績。測試時若小鼠停留在平臺上超過了3 min，其潛伏期以180s計。

2.4 給藥后學習記憶成績測試 于學習記憶成績測試后第二天開始給藥。依據劑量估換計算公式，全方組及各拆方組每天分別給予相應藥物灌胃（14.3g·kg－1·d－1）；空白組和模型組每天給生理鹽水灌胃（0.5mL·d－1），共30d。最后一次給藥30min后，進行學習成績測試，24h后再次測試記憶成績。

2.5 SYN，RAGE測定 測試結束后處死小鼠，取右側腦組織，4%多聚甲醛固定24h，石蠟包埋，石蠟切片機切片，切片厚度4μm，每張切片含皮層、海馬、齒狀回，每只小鼠取5張切片，4張進行免疫組化染色，一張HE染色。免疫組化染色法檢測各組小鼠皮層和海馬SYN、RAGE表達水平。

2.6 圖像分析 每組選取對應斷面的切片，采用Image－Pro Plus3.0軟件進行圖像采集與分析，檢測陽性反應物質的平均灰度值。

2.7 統計學方法 使用SPSS13.0進行統計學分析，各組數據用±s表示，各組數據的均衡性檢驗采用t檢驗。各組間差異用單因素方差分析，如滿足方差齊性要求采用LSD法（Least－significant difference，最小顯著差異法）進行兩兩比較，如不滿足，則采用Dunnett’T3法。P＜0.05有統計學意義。

3 結 果 3.1 鋁中毒對AD模型小鼠學習記憶的影響

與空白組比較，模型組小鼠記憶潛伏期明顯縮短（P＜0.01），學習潛伏期明顯延長（P＜0.01）；學習與記憶的錯誤次數明顯增多（P＜0.01），表明用鋁中毒所造成的AD小鼠模型學習記憶功能明顯受損。除空白組外，其余各組間比較，學習記憶潛伏期及學習記憶錯誤次數均無明顯差異（P＞0.05）。

3.2 腦爾康及其拆方組對AD模型小鼠腦內RAGE表達的影響 見表1。各用藥組RAGE表達有不同程度的下降（P＜0.01或P＜0.05），以全方組及拆方1號組效果最為明顯，且二者拮抗RAGE表達的效果無明顯差異，并優于拆方2、3、4號組。

表1 腦爾康及其拆方組對AD模型小鼠腦內RAGE表達的影響（灰度值）

3.3 腦爾康及其拆方組對AD模型小鼠腦內SYN表達的 影響 見表2。

表2 腦爾康及各拆方對AD模型小鼠腦內SYN表達的影響（灰度值）

4 討 論 本課題選用的腦爾康具有益智健腦，活血化瘀，補腎生髓之功效。方中人參、黃芪補中益氣安神為君藥；益智仁、首烏，熟地，健脾補腎生髓共為臣藥；丹參、川芎活血化瘀共為佐藥；菖蒲、冰片，開竅醒神共為使藥。組方原則符合中醫以髓海不足和痰濁內阻為AD病因病機的認識。本實驗中拆方研究采用君臣佐使化裁法［6］，彌補了以往單純利用數學模式進行分析的拆方方法，更好的反映出各藥之間的協同拮抗等配伍關系。

老年斑主要成分β淀粉樣蛋白（β－amyloid，Aβ）誘發的級聯反應是AD的主要病理機制［7］。RAGE屬于細胞表面免疫球蛋白超家族成員，在神經元、小膠質細胞及血管內皮細胞的表面均有表達。RAGE不但是Aβ跨血腦屏障內向轉運的主要受體，還可以和可溶性Aβ單體結合，造成神經元損傷及突觸可塑性降低，在AD的病理中還發揮主要作用［8－9］。RAGE在中樞神經系統表達的增加除造成血管系統自身炎癥外，還促進Aβ跨血腦屏障內流，造成腦組織Aβ沉積及炎癥反應的進一步加劇。作者的研究發現，各用藥組可明顯降低RAGE在海馬和皮質的表達，其中全方組和拆方1號組作用最為顯著。這提示腦爾康防治AD的機制之一可能是通過降低RAGE的表達來實現的，推測腦爾康改善AD模型小鼠抗癡呆可能與通過降低RAGE的表達從而拮抗Aβ的神經毒性作用有關。

研究發現AD患者腦內一個重要的病理改變是皮質和海馬內突觸聯系的丟失。中樞神經系統許多功能通路因突觸的丟失而中斷了聯系，引起多方面的功能障礙，其中最明顯的是認知和記憶障礙。突觸素的表達可以作為突觸前終末的特異性標志物，用來檢測突觸的密度和分布。作者的研究發現模型組小鼠皮質和海馬內突觸素免疫反應產物較空白組及各用藥組明顯降低，小鼠的學習記憶能力顯著下降，說明突觸素變化對學習記憶能力具有重要的影響。本研究認為突觸素的減少主要是由于鋁選擇性的蓄積在大腦受累的神經元，使神經元的代謝及蛋白質的合成能力受損，同時軸漿運輸減慢，使得軸突終末突觸素合成顯著減少。本實驗中，各用藥組海馬區和皮質突觸素免疫反應產物明顯高于模型組，其中全方組和拆方1號組作用最為顯著，且兩組無明顯差異。說明腦爾康方及拆方1號組促進了海馬區和皮質突觸素表達，提示拆方1號及腦爾康改善AD小鼠學習記憶能力的機制，可能是通過增加突觸素的含量和突觸的數量促進皮質和海馬內突觸重建和改建發揮腦保護作用。本實驗通過拆方研究對復方中藥腦爾康進行精簡，為進一步研制出處方更加精煉、效果更加顯著的抗癡呆新藥提供實驗依據。

［1］ 李 璽，喬成林，張雪飛.腦爾康對老年癡呆小鼠腦內膽堿酯酶活性及神經元影響 ［J］.西安醫科大學學報，2011，22（2）：17－19.

［2］ 李 璽，張英澤，喬成林.腦爾康對AD模型小鼠腦內一氧化氮合酶活性的影響 ［J］.中國老年學雜志，2012，22（10）：75－76.

［3］ 袁海峰，李 璽，張智燕.腦爾康對AD模型小鼠腦內APP，Aβ表達的影響 ［J］.中國實驗方劑學雜志，2011，17（24）：140－142.

［4］ 馬新欣，李 璽，侯吉星，等.腦爾康及其拆方組隊阿爾茨海默病小鼠模型腦內BDNF表達的影響［J］.中國實驗方劑學雜志，2012，18（22）：227－232.

［5］ 楊開艷.阿爾茨海默病模型建立及干預實驗研究進展［J］.南通大學學報：醫學版，2007，27（2）：151.

［6］ 劉 晴，施建蓉.中藥復方拆方研究［J］.中西醫結合學報，2013，9（1）：173.

［7］ Blennow K，De Leon MJ，Zetterberg H.Alzheimer’s disease［J］.Lancet，2006，368（9533）：387－403.

［8］ Jeynes B，Provias J.Evidence for altered LRP／RAGE expression in Alzheimer＇s lesion pathogenesis［J］.Curr Alzheimer＇s Res，2008，5（5）：432－437.

［9］ Lue LF，Walker DG，Jacobson S.Receptor for advanced glycation end products：its role in Alzheimer’s disease and other neurological diseases［J］.Future Neurol，2009，4（2）：167－177.