去甲斑蝥素對人肝癌SMMC－7721細(xì)胞凋亡相關(guān)因子半胱天冬酶3、bax和細(xì)胞色素C表達(dá)的影響

張 梅 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室 （哈爾濱150040）

去甲斑蝥素的化學(xué)結(jié)構(gòu)和天然藥物斑蝥素類似，僅在后者的1，2位去甲基，已能人工化學(xué)合成。經(jīng)過化學(xué)結(jié)構(gòu)的修改，可大大降低斑蝥素對泌尿系統(tǒng)的刺激性，國內(nèi)外文獻(xiàn)通過體內(nèi)外研究證實去甲斑蝥素對多種人惡性腫瘤細(xì)胞具有一定的抑制作用，而其抗腫瘤活性的機制是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［1－3］。去甲斑蝥素目前已用于臨床治療胃癌、肝癌和食管癌等，除了能有效抑制腫瘤細(xì)胞生長之外，還有升白細(xì)胞的臨床作用［4－5］。本研究主要討論去甲斑蝥素對人肝癌SMMC－7721細(xì)胞增殖的影響，并嘗試通過分子生物學(xué)手段探討其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用機制。

1 試劑和儀器 1.1 藥物和試劑 去甲斑蝥素（山東信誼制藥有限公司，批號20130527）；RPMI－1640培養(yǎng)基（美國Gibico公司）；小牛血清（武漢華美生物工程公司）；胰蛋白酶（美國 Gibco公司）；3－（4，5－二甲基噻唑－2）－2，5－二苯基四氮唑溴鹽（MTT）（上海普飛生物技術(shù)有限公司）；細(xì)胞培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)板（美國Costar公司）。Annexin V－FITC／PI凋亡檢測試劑盒（美國Beckman Coulter公司）；線粒體－胞漿分離試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）；活化半胱天冬酶3（caspase－3）、bax、細(xì)胞色素C抗體（美國Bioworld公司）。

1.2 儀 器 LDZ5－2型離心機（北京醫(yī)用離心機廠）；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（美國Forma公司）；倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；Epics－XL－Ⅱ型流式細(xì)胞儀（美國Beckman Coulter公司）；ELx808型吸收光酶標(biāo)儀（美國伯騰儀器公司）。

1.3 細(xì) 胞 人肝癌SMMC－7721細(xì)胞株（中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心）。將SMMC－7721細(xì)胞株置含有10%小牛血清和80U／L慶大霉素的RPMI－1640細(xì)胞培養(yǎng)基（pH＝7.4）內(nèi)，在37℃恒溫、5%CO2環(huán)境下孵育。

2 方 法 2.1 腫瘤細(xì)胞生長抑制率 將對數(shù)生長期的SMMC－7721細(xì)胞株用培養(yǎng)基稀釋至細(xì)胞濃度為105個／mL，將100μL細(xì)胞液分別接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的每個孔內(nèi)，在37℃恒溫和5%CO2環(huán)境下孵育24h后再加入等體積去甲斑蝥素的培養(yǎng)基溶液，去甲斑蝥素的終濃度為1、5、25、125mg／L，以上各個濃度梯度作為藥物組，另用不加藥物的細(xì)胞孔作為對照組，用培養(yǎng)基作為空白組，藥物組、對照組、空白組均設(shè)置平行孔以減少實驗誤差。在24h、48h和72h后避光操作加入5mg／mL濃度的MTT溶液20μL，繼續(xù)37℃恒溫避光培養(yǎng)細(xì)胞3h后結(jié)束培養(yǎng)。在每個孔中加入0.15mL二甲亞砜，處理5min后將培養(yǎng)板置酶標(biāo)儀中，在波長570nm處測定吸光值，通過空白組的平均吸光值校正藥物組和對照組的吸光值，則：腫瘤細(xì)胞生長抑制率（%）＝（1－藥物組吸光值／對照組吸光值）×100%。

2.2 腫瘤細(xì)胞凋亡率 收集培養(yǎng)24h后的SMMC－7721細(xì)胞，用無水乙醇固定，置－70℃冰箱中保存。用磷酸鹽緩沖液沖洗固定后的細(xì)胞，1200r／min離心5min，分別加入熒光染色劑Annexin V－FITC使成終濃度20μg／mL，避光染色20min，再加入5μL PI染色劑使成終濃度50μg／mL，在37℃下避光染色40min，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期的變化。

2.3 caspase－3、bax和細(xì)胞色素C的表達(dá) 對照組和藥物組細(xì)胞培養(yǎng)24h后，采用磷酸鹽緩沖液沖洗分散和沖洗3遍，在3000r／min下離心10min，將沉淀懸浮在200μL預(yù)冷的細(xì)胞裂解液中，冰浴1h后在12000r／min下離心20min，棄去沉淀得到細(xì)胞的總蛋白，而檢測細(xì)胞色素C表達(dá)水平采用胞漿蛋白。將緩沖液加入上述蛋白，在沸水中水浴10min，采用聚丙烯酰胺（SDS－PAGE）凝膠電泳法分離不同類型的蛋白，再轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜后，在37℃恒溫下處理50min，采用免疫印跡法按步驟獲得熒光二抗后測定caspase－3、bax和細(xì)胞色素C的表達(dá)水平。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計量資料的比較采用t檢驗，檢驗水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié) 果 3.1 腫瘤細(xì)胞生長抑制率 不同濃度的去甲斑蝥素對SMMC－7721細(xì)胞有不同的抑制率，表現(xiàn)出對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用（n＝6）。相同濃度的去甲斑蝥素作用時間越長，細(xì)胞生長抑制率越高；作用相同時間的去甲斑蝥素濃度越高，細(xì)胞生長抑制率越高。去甲斑蝥素對SMMC－7721細(xì)胞生長抑制率見表1。

表1 去甲斑蝥素對SMMC－7721細(xì)胞生長的抑制率（±s）

表1 去甲斑蝥素對SMMC－7721細(xì)胞生長的抑制率（±s）

去甲斑蝥素濃度（mg／L）細(xì)胞生長抑制率（%）作用24h后 作用48h后 作用72h后1 6.24±1.49 9.48±2.65 23.46±6.97 5 20.45±3.86 24.07±4.16 38.65±6.43 25 36.57±8.40 46.71±8.52 59.56±7.25 125 59.30±12.12 58.45±9.85 81.24±13.12

3.2 腫瘤細(xì)胞凋亡率 經(jīng)過不同濃度去甲斑蝥素處理的SMMC－7721細(xì)胞恒溫培養(yǎng)24h后，通過流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞的凋亡情況（n＝6），結(jié)果見表2。藥物組細(xì)胞均有不同程度的早期凋亡和晚期凋亡。隨著去甲斑蝥素濃度的提高，總凋亡率相應(yīng)升高；藥物組的總凋亡率均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝10.758、16.931、33.955、22.358，P 均＜0.05）。

表2 去甲斑蝥素對SMMC－7721細(xì)胞的凋亡率（±s）

表2 去甲斑蝥素對SMMC－7721細(xì)胞的凋亡率（±s）

注：與對照組比較，△P＜0.05

去甲斑蝥素濃度（mg／L）早期凋亡率（%） 晚期凋亡率（%）總凋亡率（%）對照組0.12±0.08 0.31±0.12 0.43±0.11 1 4.54±2.49 9.46±3.28 14.01±3.09△5 11.74±4.58 23.95±3.09 35.69±5.10△25 20.07±6.15 48.38±9.11 68.46±8.24△125 27.67±8.19 61.03±10.80 88.70±9.67△

表3 去甲斑蝥素對caspase－3、bax和細(xì)胞色素C表達(dá)的影響（±s）

表3 去甲斑蝥素對caspase－3、bax和細(xì)胞色素C表達(dá)的影響（±s）

注：與對照組比較，△P＜0.05

去甲斑蝥素濃度（mg／L）積分吸光度caspase－3 bax 細(xì)胞色素C對照組0.21±0.08 0.16±0.05 0.18±0.06 1 0.19±0.07 0.13±0.04 0.25±0.05 5 0.23±0.11 0.15±0.06 0.18±0.07 25 0.46±0.12△ 0.22±0.03△ 0.50±0.12△125 0.77±0.19△ 0.46±0.09△ 0.48±0.14△

3.3 caspase－3、bax和細(xì)胞色素C的表達(dá) 經(jīng)過不同濃度去甲斑蝥素處理的SMMC－7721細(xì)胞恒溫培養(yǎng)24h后，通過免疫印跡法測定caspase－3、bax和細(xì)胞色素C的積分吸光度（n＝6），結(jié)果見表3。可見，隨著去甲斑蝥素的濃度提高，caspase－3、bax和細(xì)胞色素C的表達(dá)量均升高；濃度為25、125mg／L的去甲斑蝥素處理細(xì)胞后，caspase－3、bax和細(xì)胞色素C的蛋白表達(dá)量均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝4.246、2.521、5.842、6.654、7.137、4.825，P 均＜0.05）。

4 討 論 斑蝥素是昆蟲斑蝥的主要抗腫瘤有效成分，可治療食管癌、肝癌、胃癌和乳腺癌等多種惡性腫瘤疾病，然而斑蝥素口服后會產(chǎn)生較嚴(yán)重的胃腸道不良反應(yīng)，限制其臨床進(jìn)一步推廣應(yīng)用［6］。去甲斑蝥素去除斑蝥素分子中的1，2位兩個甲基，并實現(xiàn)人工合成，價格較低廉，可大大降低消化道不良反應(yīng)的發(fā)生率，且具有與斑蝥素相同的抗腫瘤活性，還有升高白細(xì)胞的作用，骨髓抑制現(xiàn)象較少見［7－8］。近年來有關(guān)去甲斑蝥素的藥理作用研究逐步深入開展，并可制備成多種藥物新劑型［9－11］，大大拓展了其臨床應(yīng)用前景，但在分子生物學(xué)水平對去甲斑蝥素的研究尚需進(jìn)一步探討和明確。

采用MTT染色可檢測藥物對腫瘤細(xì)胞生長的抑制情況。本研究發(fā)現(xiàn)不同濃度的去甲斑蝥素均有對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。濃度為25mg／L的去甲斑蝥素作用48h時間后，以及濃度為125mg／L的去甲斑蝥素作用24h時間后，細(xì)胞生長抑制率均超過50.00%。因此，去甲斑蝥素對SMMC－7721細(xì)胞的抑制作用具有明顯的劑量－時間相關(guān)性，越高的藥物濃度和越長的作用時間可產(chǎn)生更大的抑制率。通過流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞的凋亡情況，可見去甲斑蝥素可促進(jìn)SMMC－7721細(xì)胞的早期凋亡和晚期凋亡，且凋亡率與劑量有相關(guān)性，隨著去甲斑蝥素濃度的提高，總凋亡率相應(yīng)升高。這表明去甲斑蝥素是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡抑制SMMC－7721細(xì)胞的生長。

半胱天冬酶家族為介導(dǎo)和執(zhí)行腫瘤細(xì)胞凋亡的相關(guān)因子，caspase－3可破壞腫瘤細(xì)胞內(nèi)的調(diào)節(jié)蛋白與結(jié)構(gòu)蛋白，而bax和細(xì)胞色素C也均與細(xì)胞凋亡過程有關(guān)［12］。腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞色素C在線粒體表達(dá)而轉(zhuǎn)運至細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，激活caspase－3酶原使之成為活性caspase－3發(fā)揮細(xì)胞凋亡的作用［13］。bax是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)節(jié)因子，參與線粒體外膜的蛋白轉(zhuǎn)運通道的形成，促進(jìn)細(xì)胞色素C的轉(zhuǎn)運，并可降低機體內(nèi)原癌基因?qū)δ[瘤細(xì)胞增殖的抑制作用［14－15］。本研究結(jié)果表明，去甲斑蝥素可提高caspase－3、bax和細(xì)胞色素C的表達(dá)量，且以上三種凋亡因子的表達(dá)量與去甲斑蝥素的劑量有相關(guān)性，濃度為25、125mg／L的去甲斑蝥素處理細(xì)胞后，caspase－3、bax和細(xì)胞色素C的蛋白表達(dá)量顯著提高。因此，去甲斑蝥素誘導(dǎo)SMMC－7721細(xì)胞凋亡的作用機制在于上調(diào)bax的表達(dá)量，促進(jìn)線粒體中的細(xì)胞色素C釋放入細(xì)胞質(zhì)內(nèi)激活caspase－3酶原為活性caspase－3，最終活性caspase－3直接執(zhí)行了腫瘤細(xì)胞的早期凋亡和晚期凋亡過程。

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