β－受體激動劑質譜裂解特征研究

應永飛朱聰英周 煒屈 健陸春波汪以真

（1.浙江大學動物科學學院，杭州310058；2.浙江省畜產品質量安全檢測中心，杭州310020）

β－受體激動劑質譜裂解特征研究

應永飛1，2，朱聰英2，周 煒2，屈 健2，陸春波2，汪以真1

（1.浙江大學動物科學學院，杭州310058；2.浙江省畜產品質量安全檢測中心，杭州310020）

以克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇為代表，闡明了β－受體激動劑在正離子軟電離模式下的裂解機理。采用AB SCIEX 5500 QTRAP三重四級桿電噴霧質譜儀，運用IDA－EPI技術，對β－受體激動劑類化合物裂解規律進行研究解析。結果表明，在ESI正電離模式下β－受體激動劑容易獲得H＋而形成［M＋H］＋準分子離子峰，該結構易丟失水分子（H2O，繼而與氨基結構相連的碳氮鍵（－C－N－）發生斷裂，形成與苯環共軛的（Ph－CH＝CH－NH＋－）離子結構。本研究為同類化合物的結構解析提供了可靠依據以及跟蹤新型β－受體激動劑提供了有力手段。

β－受體激動劑；質譜裂解；液相色譜－串聯質譜法

β－受體激動劑是一種化學結構和生理功能類似腎上腺素和去甲腎上腺素的苯乙醇胺類化合物，因該類物質可以加快畜禽生長，降低胴體脂肪含量，提高瘦肉率，曾被作為促生長劑在飼料和飲水中添加使用［1］。由于該類化合物易在動物組織中形成殘留，人們食用后曾多次發生中毒事件，所以我國已全面禁止該類化合物作為生長促進劑在動物養殖中使用［2］。但是，由于經濟利益的驅使，目前仍被少數不法分子非法添加到飼料中，且近年來新型藥物不斷出現［2］，因此需要對β－受體激動劑進行有效的檢測和監控。

質譜圖是化合物結構的直觀反映［3］，質譜分析

具有檢測速度快、靈敏度高和樣品耗費少等優點，已成為復雜體系中痕量組分分析的一種重要方法［4］。 雖然有關動物尿液［5－6］、牛奶［7］、動物組織［8－9］β－受體激動劑檢測的文獻已有大量報道，但是，針對其質譜裂解機理研究的文獻鮮見報導，且以Q－TOF等高分辨質譜檢測方法為主［10－11］。本研究采用AB SCIEX 5500 QTRAP三重四級桿－線性離子阱電噴霧質譜儀，通過調節源內碰撞裂解（源內CID）能量，繼而利用三重四級桿－線性離子阱實現準 MS／MS／MS［12］，對克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇3種化合物的裂解行為進行了考察，分別代表苯胺型、苯酚型和水楊酸型三種結構，研究它們在正離子軟電離狀態下的裂解行為。本研究為同類化合物的結構解析提供了可靠依據，為跟蹤新型β－受體激動劑提供了有力手段，具有較強的理論意義和實用價值（圖1）。

圖1 三種β－受體激動劑化學結構式

1 材料與方法

1.1 儀器 Agilent 1290N 高效液相色譜儀（Agilent公司，美國），AB SCIEX 5500 QTRAP三重四級桿－線性離子阱電噴霧質譜儀（ABSCIEX公司，美國），配電噴霧離子源（ESI）；Hamilton 1000 μL注射器 （Hamilton 公 司，美 國）；MS3minishaker旋渦混勻器（IKA公司，德國）；XS－205電子天平（METTLER公司，瑞士）。

1.2 標準物質與試劑 克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇標準品（Dr.Ehrenstorfer公司，德國）；甲醇、乙腈、甲酸，均為色譜純（Merck公司，美國）；實驗用水為Milli－Q超純水。

1.3 質譜條件與方法 離子源：電噴霧離子源；監測模式：正離子掃描模式；離子源電壓為5500 V；輔助加熱氣溫度為500℃；氣簾氣流速為40 L／h；脫溶劑氣流速為中等；霧化氣和輔助氣均為45 L／h；質量全掃描范圍為m／z50～450。試驗方法包括：進樣方式為注射器直接進樣，流速為5 μL／min；碰撞氣為N2。同時利用源內CID對準分子離子［M＋H］＋進行MS2分析，然后再對產生的碎片離子進一步進行四極桿－線性離子阱CID（MS3）分析，結合IDA－EPI掃描，獲得相應的子離子質譜圖，進行待測物的裂解特征研究。

1.4 樣品制備 分別稱取克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇標準物質適量，用甲醇配制成濃度均為1.0 mg／mL標準儲備液。準確量取1.0 mL儲備液分別置于100 mL容量瓶中，用甲醇配制成濃度均為10 μg／mL標準中間液。分別取20 μL標準中間液，用0.1%甲酸溶液／甲醇（9∶1，V／V）稀釋至1 mL，三種β－受體激動劑標準工作液的最終濃度為200 ng／mL，用注射器直接進樣分析。

2 結果

2.1 克倫特羅的裂解特征解析 由圖2可以發現，克倫特羅的準分子離子峰［M＋H］＋為m／z277、279、281，其豐度比約為9∶6∶1，這與每個分子中含有2個Cl原子的結構一致，與文獻報道吻合［3］。因m／z277靈敏度最高，作為母離子對其進行子離子掃描CID（MS2），結果產生了m／z259、203、168和132等碎片離子。其中，m／z259對應于［M＋H－18］＋，通過比較兩離子之間質量差值，確定脫去的碎片（m／z18）為H2O分子。由m／z259碎片離子經結構重排后，失去（2－甲基丙烯）得到m／z203的特征碎片。而m／z168與m／z203質量數相差35，這恰好為Cl原子的質量，故可確認它是脫去氯自由基（Cl·）后形成的碎片，m／z168進一步丟失m／z36（HCl）形成碎片離子m／z132。進一步對主要子離子m／z203進行源內CID（MS3）分析，其準三級質譜圖見圖3，結果生成了m／z168和132碎片，與MS2結果一致，其可能裂解途徑見圖4。

圖2 三種β－受體激動劑［M＋H］＋離子的ESI－MS2圖譜

圖3 三種β－受體激動劑［M＋H］＋離子的ESI－MS3圖譜

圖4 克倫特羅［M＋H］＋離子可能的ESI－MS2裂解途徑

2.2 沙丁胺醇的裂解特征解析 由圖2可以發現，沙丁胺醇的準分子離子峰［M＋H］＋為m／z240，作為母離子對其進行子離子掃描CID（MS2），結果產生了m／z222、204、166和148等碎片離子。其中，m／z222相應于［M＋H－18］＋，通過比較兩離子之間質量差值，確定脫去的碎片（m／z18）為H2O分子，因沙丁胺醇的水楊酸結構，苯甲醇結構再脫去一個H2O分子（m／z18），得到碎片離子m／z204。由m／z222碎片離子經結構重排后，失去2－甲基丙烯（m／z56）得到m／z166的特征碎片。而m／z166與再脫去一個H2O分子（m／z18）得到碎片離子m／z148。進一步對主要子離子m／z222進行源內CID（MS3）分析，其準三級質譜圖見圖3，結果生成了m／z204、166和148碎片，與MS2結果一致，其可能裂解途徑見圖5。相對于苯胺型和苯酚型的β－受體激動劑，水楊酸型結構的沙丁胺醇的裂解過程比較典型，也更具有代表性。

2.3 萊克多巴胺的裂解特征解析 由圖2可以發現，萊克多巴胺的準分子離子峰［M＋H］＋為m／z302，作為母離子對其進行子離子掃描CID（MS2），結果產生了m／z284、164、136和121、107、91等碎片離子。通過比較兩離子之間質量差值，m／z284相應于［M＋H－18］＋，確定脫去的碎片（m／z18）為H2O分子。采用源內進一步對主要子離子m／z284、164、136進行源內CID（MS3）分析，其準三級質譜圖見圖3，結果發現m／z284→m／z164→m／z121具有相關性，而m／z284不能直接產生m／z136、107等碎片離子，故這些離子可能由準分子離子峰［M＋H］＋m／z302直接產生。

由于萊克多巴胺氨基左右結構基本對稱，故而碎片離子較為豐富，為結構鑒定提供了足夠信息，其可能裂解途徑見圖6。

圖5 沙丁胺醇［M＋H］＋離子可能的ESI－MS2裂解途徑

圖6 萊克多巴胺［M＋H］＋離子可能的ESI－MS2裂解途徑

3 討論

電噴霧電離是一種軟電離技術，其優點在于容易得到相對分子質量的信息，但軟電離技術所生成的準分子離子過剩的內能較少，往往產生的碎片離子很有限。而三重四級桿質量分析器的工作原理是先測得準分子離子，然后選中該離子通過適當碰撞誘導解離能量將其打碎，從而獲得更多的結構信息，因此，電噴霧結合三重四級桿質量分析器是結構分析的理想選擇。

3.1 一級全掃描質譜分析 采用電噴霧離子源，在正離子監測模式下對三種β－受體激動劑進行質譜分析。在一級全掃描質譜分析中，克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇均檢測到信號很強的準分子離子峰［M＋H］＋（均為基峰）。推測這可能與化合物本身結構有關，此類化合物含有氨基（－NH）結構，易與質子結合形成季銨鹽的穩定結構，故加合峰響應值很高。

3.2 質譜數據分析及裂解規律研究 為了研究分子結構與裂解途徑之間的關系，分別對三種β－受體激動劑的［M＋H］＋準分子離子峰進行CID分析，從低到高調節適宜的碰撞能量，使其［M＋H］＋峰產生穩定的碎片離子，探討該類化合物的質譜裂解途徑。

由于β－受體激動劑均屬于苯乙醇胺類化合物，具有基本骨架相同、結構類似的特點，但苯環上及氨基連接官能團有差異，所以它們的ESI－MS／MS行為應存在著相似性和差異性。通過比較化合物的結構信息和質譜信息，發現它們在軟電離狀態下均存在丟失中性分子H2O的裂解途徑。同時利用源內CID對［M＋H］＋離子進行MS2分析，然后對產生的碎片離子進一步進行四極桿－線性離子阱CID（MS3）分析，獲得相應的子離子質譜圖。

3.3 電噴霧電離的裂解方式 電噴霧電離作為一種軟電離技術，通常易于丟失中性小分子，進而生成穩定性較高的離子，本試驗也證明了這一點。因β－受體激動劑都含有苯乙醇胺的母體結構，所以在ESI正電離模式下容易獲得H＋而形成［M＋H］＋準分子離子峰，該結構易丟失H2O等中性分子，以水楊酸型的β－受體激動劑最為典型。該類化合物氨基結構相連的（－C－N－）鍵容易斷裂，產生與苯環共軛的（Ph－CH＝CH－NH－）離子結構。這兩對子離子的豐度較高，易于檢測，可作為此類化合物及其衍生物定性分析中的“診斷”離子。

3.4 含氯化合物的裂解規律探討 除克倫特羅外，克倫塞羅、氯丙那林等很多β－受體激動劑藥物結構中都含有Cl原子，因此質譜圖中有氯化物特征同位素峰的出現，這是由于自然界中37Cl與35Cl的天然豐度之比約為1∶3。這種特征為此類藥物的定性分析和碎片歸屬提供了極為有用的依據。由于此類藥物結構中的 Cl原子與苯環直接相聯，屬于芳香族氯化物，所以裂解時Cl原子以中性自由基方式異裂［13］，顯示出［M＋H－Cl］＋強峰，提供了典型碎片離子。

4 結論

本實驗采用AB SCIEX 5500 QTRAP三重四級桿電噴霧質譜儀，對三種代表性β－受體激動劑質譜裂解機理進行了研究，對其中可能的解離途徑進行了解析。在ESI正電離模式下，β－受體激動劑容易獲得H＋而形成［M＋H］＋準分子離子峰，該結構易丟失H2O等中性分子，而與氨基結構相連的（－CN－）鍵容易斷裂，產生與苯環共軛的（Ph－CH＝CHNH＋－）離子結構。鑒于β－受體激動劑苯乙醇胺類化學結構的類似性，本研究也為其他β－受體激動劑的質譜解析提供了理論依據。

［1］應永飛，朱聰英，陳慧華，等.多壁碳納米管分散固相萃取結合LC－MS／MS測定飼料中11種β－受體激動劑［J］.中國畜牧雜志，2013，49（9）：68－73.

［2］中華人民共和國農業部.農業部公告第1519號［S］.

［3］李 馨，王英武，顧景凱，等.三唑侖苯二氮卓類藥物的電噴霧質譜裂解特征［J］.分析化學，2003，31（9）：1105－1108.

［4］郭澤琴，霍佳麗，王建華，等.β－內酰胺類抗生素質譜裂解機理研究［J］.質譜學報，2014，35（1）：45－51.

［5］Williams L D，Churchwell M I，Doerge D R.Multiresidue confir?mation of β－agonists in bovine retina and liver using LC－ES／MS／MS［J］.J Chromatogr B，2004，813（1／2）：35－45.

［6］Nielen M W F，Lasaroms J J P，Essers M L，et al.Multiresidue analysis of beta－agonists in bovine and porcine urine，feed and hair using liquid chromatography electrospray ionisation tandem mass spectrometry［J］.Anal Bioanal Chem，2008，391（1）：199－210.

［7］Li C，Wu Y L，Yang T，et al.Simultaneous determination of clenbuterol，salbutamol and ractopamine in milk by reversedphase liquid chromatography tandem mass spectrometry with isotope dilution［J］.J Chromatogr A， 2010， 1217（50）：7873－7877.

［8］吳平谷，應永飛，陳慧華，等.同位素稀釋結合固相萃取快速測定動物組織中 β2－興奮劑［J］.分析化學，2007，35（3）：330－334.

［9］Zhang X Z，Gan Y R，Zhao F N.Determination of clenbuterol in pig liver by high－performance liquid chromatography with a coulometricelectrode array system［J］.Anal Chim Acta，2003，（489）：95－101.

［10］Wang X J，Zhang F，Ding F，et al.Simultaneous determination of 12 β－agonists in feeds by ultra－high－performance liquid chromatography－quadrupole－time－of－flight mass spectrometry［J］.J Chromatogr A，2013，1278：82－88.

［11］王英武，顧景凱，王 玲，等.電噴霧電離－四極桿飛行時間質譜法研究三種β2－受體激動劑的質譜裂解特征［J］.質譜學報，2004，25（2）：69－72.

［12］焦豪妍，許風國，田 媛，等.氟喹諾酮類化合物電噴霧質譜裂解規律［J］.中國抗生素雜志，2009，34（6）：344－347.

［13］陳耀祖，涂亞平.有機質譜原理及應用［M］.北京：科學出版社，2001：149－150.

（編輯：侯向輝）

Study on Mass Spectral Characteristics of β－receptor Agonists

YING Yong－fei1，2，ZHU Cong－ying2，ZHOU Wei2，QU Jian2，LU Chun－bBo2，WANG Yi－zhen1
（1.College of Animal Sciences，Zhejiang University，Hangzhou310058，China；2.Animal Products Quality Testing Centre of Zhejiang Province，Hangzhou310020，China）

To clarify pyrolysis mechanism of β－receptor agonists under positive mode，representative drugs including clenbuterol，salbutamol and ractopamine had been chosen to study with AB SCIEX 5500 QTRAP triple quadrupole mass spectrometry and IDA－EPI technology.The results showed that under ESI positive mode，βreceptor agonists were easy to form ［M＋H］＋.The structure was easy to loss neutral molecules，such as H2O.Moreover，the C－N bond connected with amino group was easy to broken and produce conjugated ion structure with benzene.This study had important theory research significance and practical value，such as providing reliable basis for other β－receptor agonists structural analysis and providing powerful means to track new β－receptor agonists.

β－receptor agonists；mass spectral characteristics；liquid chromatography－tandem mass spectrometry

2014－10－14

A

1002－1280（2015）01－0052－06

S859.83

公益性行業（農業）科研專項（201203023－4）

應永飛，博士，從事飼料安全檢測研究。E－mail：yyf1001＠163.com