麻黃附子細辛湯聯合抗生素體外抗肺炎克雷伯菌作用研究

楊 露,謝曉芳,胡 榮

(1.成都中醫藥大學 圖書館， 四川 成都 610075； 2.成都中醫藥大學 藥學院 測試中心，四川 成都 611137)

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麻黃附子細辛湯聯合抗生素體外抗肺炎克雷伯菌作用研究

楊 露1,謝曉芳2,胡 榮2

(1.成都中醫藥大學 圖書館， 四川 成都 610075； 2.成都中醫藥大學 藥學院 測試中心，四川 成都 611137)

目的：研究麻黃附子細辛湯與抗生素聯合應用對抗生素的增效作用。方法：將各組培養基分別接種肺炎克雷伯菌后37℃培養過夜，空白組不接種細菌，每12h取出計數，計算活菌數。結果：中藥復方組12h時發現細菌逐漸生長，直至培養120h后細菌濃度才逐漸下降，培養180h時細菌濃度保持不變;頭孢唑林組培養12h時細菌數逐漸減少，到60h時細菌減少的趨勢停止；中藥復方聯合頭孢唑林組培養12h時細菌數量逐漸減少，并在培養144h時各組細菌無生長跡象,替加環素藥物干預后細菌數急劇下降，但是直到觀察結束仍有部分細菌存活；陰性組細菌隨著培養時間的延長呈現緩慢生長趨勢；空白組無細菌生長。結論：麻黃附子細辛湯聯合抗生素具有更明顯的抗菌效應，可能與它激活耐藥細菌生長有關。

麻黃附子細辛湯；抗肺炎；克雷伯菌；抗生素；細菌生長；抗菌

抗生素的廣泛使用甚至濫用導致細菌耐藥性問題日趨嚴峻，雖然針對耐藥菌研發新型抗生素的工作從未停止，但是抗生素資源是相對有限的，新型抗生素的開發速度遠不及細菌產生耐藥性的速度。肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumoniae，KP)是一種存在于人體上呼吸道和腸道的革蘭氏陰性桿菌，近年來已成為引起社區獲得性感染和醫院感染的最重要病原菌之一[1]。由于大量抗生素的廣泛使用，KP已成為產超廣譜β-內酰胺酶的代表菌種，耐藥性問題日益突出[2]。有研究表明，KP對頭孢唑林的耐藥率達33.5%[3]。麻黃附子細辛湯是漢代張仲景的《傷寒論》中的經典方劑，由麻黃、附子、細辛三味藥組成，具有助陽解表、溫化寒飲之功效[4]，其組方嚴謹，日本島根縣疑難病研究所的龜井勉主任在日本《醫學論壇報》上報告稱，在治療老年人耐藥菌感染時，用麻黃附子細辛湯取得了較好效果。國內也有報道用麻黃附子細辛湯治療肺炎遷延不愈，其中不乏住院后感染的老年病例 ，癥狀與克雷伯菌感染相似[5]。多項研究已證實該方具有明顯的抗病毒、消炎、刺激免疫等作用，但其抗菌機制尚未明確，近年來有文獻[6]指出“休眠”并非細菌耐藥的唯一原因，緩慢生長的細菌耐藥性雖然稍低于“休眠”細菌，但由于其數量龐大，是造成抗生素失效以及感染復發的主要原因。于是我們猜想：麻黃附子細辛湯發揮抗菌效應是否與在一定程度上促進耐藥菌生長有關？為了證實這一假設，為臨床用藥提供科學依據，我們做了實驗研究，具體如下。

1 材料及儀器

1.1 藥品及菌種

麻黃(內蒙古,批號121001)，細辛(遼寧,批號121102)，附子(四川,批號120801)，經鑒定均為正品。肺炎克雷伯菌來源于中國食品藥品檢定研究院，由成都中醫藥大學微生物教研室鑒定、保存。

1.2 儀器

隔水式電熱細胞(霉菌)培養箱(常州華冠儀器制造有限公司)，凈化工作臺(蘇州蘇潔凈化設備有限公司)，電熱恒溫鼓風干燥箱(深圳市耐美特工業設備有限公司)，自動壓力蒸汽滅菌器(上海茸研儀器有限公司)，PL 203型電子天平(瑞士METTLER TOLEDO)。

1.3 培養基

M-H液體培養基(杭州微生物試劑有限公司，批號：113627)；胎牛血清(鄭州佰安生物工程有限公司，批號：03514)；營養瓊脂(NA，規格：250g，西亞試劑在生物制藥有限公司，批號：20120205)、營養肉湯(NB，規格：250mL，上海恒遠生物科技有限公司，貨號：YH00624)。所有培養基均按產品說明書配制。

1.4 抗生素

頭孢唑林(批準文號：國藥準字 20045015，悅康藥業集團有限公司)；加環素(國藥準字：20041889，天津百特醫療用品有限公司)。

2 方法

2.1 分組

將培養基分為麻黃附子細辛湯復方組、中藥復方加頭孢唑林組、頭孢唑林組、空白組(未加藥物，未接種細菌的空白培養基)，陽性組(單純加入替加環素的培養基)、陰性組(未加藥物，接種細菌的培養基)。

2.2 復方提取

將附子、麻黃、細辛分別粉碎成直徑小于18μm的超微粉，分別精密稱取12g、6g、6g，冷水浸泡后煎煮2次，合并煎煮液，過濾，濃縮為50mg(生藥)/mL。

將0.9%NaCl溶液煮沸滅菌，置于4°C環境中備用，實驗時利用經過滅菌的0.9%NaCl溶液將受試樣本溶液配制成不同濃度梯度的液體。

2.2 細菌液的制備

將肺炎克雷伯菌接種于營養肉湯中，并靜置于37℃條件的培養箱中培養24h，隨后取出細菌液3mL，利用營養肉湯將細菌液濃度稀釋成(0.5～1)×105個/mL密度備用。

2.3 活菌計數

將不同組別的培養基分別接種肺炎克雷伯菌后混勻，冷卻，待凝固后，放入37℃培養過夜，每12h計數，觀察比較耐藥菌的生長情況。

2.4 統計學處理

將所得數據輸入EXCEL表格中，采用SPSS18.0軟件進行統計分析，獨立樣本均數間比較采用t檢驗，方差分析前采用Levene檢驗方差齊性。P<0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

中藥復方組12h時發現細菌逐漸生長，直至培養120h后細菌濃度才逐漸下降，直至培養180h時細菌濃度保持不變；頭孢唑林組培養12h時細菌數逐漸減少，到60h時細菌減少的趨勢停止；中藥復方聯合頭孢唑林組培養12h時細菌數逐漸減少，并在培養144h時各組細菌無生長跡象。替加環素藥物干預后細菌數急劇下降，但是直到觀察結束仍有部分細菌存活；陰性組細菌隨著培養時間的逐漸延長呈現緩慢生長趨勢。具體見圖1。

圖1 肺炎克雷伯菌生長曲線

4 討論

我國既是抗生素生產大國，也是抗生素使用大國。相關資料顯示，我國年產抗生素原料大約2.1×108kg，其中3×107kg用于出口，剩余近1.8×108kg完全由國內市場消化(包括醫療與農業使用)，人均年消費量達到驚人的138g(美國僅13g)。由于人類濫用抗生素，現在一代耐藥菌的產生只要2年時間，而醫藥工作者開發一種新的抗生素大約需要10年時間，抗生素的研制速度已經遠遠跟不上耐藥菌的產生速度。耐藥菌感染給臨床工作帶來了極大挑戰[7-8]。《Cell》[6]雜志曾報道：受到感染的機體組織中細菌對抗生素的敏感性不盡相同，部分生長緩慢的致病菌表現出明顯的耐藥性，“休眠”并非是細菌耐藥的唯一原因，緩慢生長的細菌耐藥性雖然稍低于“休眠”細菌，但由于其數量龐大，是造成抗生素失效以及感染復發的主要原因。于是針對上述情況我們做一假設：如果某種干預措施能夠促進耐藥菌的生長，是否可以作為已經被耐藥的抗生素繼續發揮滅菌作用的前提？本研究使用的KP是產超廣譜β-內酰胺酶的代表菌種，在用空白組培養基進行細菌活菌計數實驗時發現細菌生長緩慢的跡象，這與Basel大學的科學家們的發現具有一致性，驗證了“休眠”及生長緩慢的細菌均是細菌耐藥性的原因。故我們認為一定程度上加快耐藥性細菌的生長速度可能是協助抗生素殺菌的關鍵環節。

中草藥在現代醫學預防及治療細菌感染方面的作用日益受到重視，中藥制劑中具有抗菌作用的復方或單方制劑以及中西藥配伍制劑正不斷得到研究與證實。近年來國內屢有報道用麻黃附子細辛湯治療久不見癒的慢性肺炎、肺梗阻等疾病；諸多國內外報道[9-12]中患者均已經使用或單獨使用抗生素進行抗感染治療，但療效不佳，再使用或配合使用麻黃附子細辛湯治療后取得較好療效。對于麻黃附子細辛湯實驗室的抗菌譜目前研究尚少，于是我們設想：麻黃附子細辛湯發揮抗感染的作用是否與促進耐藥菌株的生長有關。

根據這一設想，本研究采用產超廣譜β-內酰胺酶的代表菌種KP，KP產生耐藥性是自身產生滅活酶、外膜孔蛋白的變化、生物膜的產生以及細菌主動外排結構的改變等多種因素共同作用的結果[13]。KP對頭孢唑林的耐藥率較高，有研究表明，KP對頭孢唑林的耐藥率達33.5%，故本實驗選用頭孢唑林為聯用抗生素。替加環素是新一代治療革蘭氏陰性菌的有效藥 ，文獻報道，新一代甘氨酰環素類抗菌藥物替加環素對克雷伯菌具有極高的敏感性[14]，故本實驗選用替加環素作為陽性對照。通過對不同組別藥物接種KP并進行觀察，發現頭孢唑林組細菌自藥物干預后活菌數逐漸減少，但在培養60h后細菌減少的趨勢停止；另一組替加環素藥物干預后細菌數急劇下降，但是直到觀察結束仍有部分細菌存活，這說明余下的細菌耐受了抗生素，導致抗生素不發揮作用；在對中藥復方組的細菌進行計數時我們發現培養12h時發現細菌逐漸生長，直至培養120h后細菌濃度才逐漸下降，直至培養180h時細菌濃度保持不變，這一現象說明中藥在干預初期引起了耐藥菌株的生長，說明部分原先處于“休眠”或者生長緩慢的菌株被激活；在中藥復方聯合抗生素組我們發現培養12h時細菌數逐漸減少，并在培養144h時各組基本無細菌生存跡象，我們推測：聯合用藥時使原先部分因為“休眠”或者生長緩慢逃過抗生素扼殺的細菌重新激活，隨之再將它們滅殺。

總之，麻黃附子細辛湯聯合抗生素對臨床耐藥病菌表現出較為理想的協同抗菌活性，可能是中藥激活細菌生長后為抗生素的滅菌提供了更為有利的環境，然而中藥是通過何種途徑激活“休眠”或者生長緩慢的耐藥菌，本階段尚未進行研究，將作為下階段的主要課題。

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(責任編輯：宋勇剛)

2014-12-20

四川省中醫藥管理局課題(2012-E-042)

楊露(1975-)，女 ，碩士，成都中醫藥大學圖書館實驗師，研究方向為中藥藥理學。

R285.5

A

1673-2197(2015)09-0018-03

10.11954/ytctyy.201509008