腎病患者血漿代謝組學分析前樣品處理方法優化

趙 靜，關 欣，包永睿，王 帥，孟憲生*，鄭紅光*

(1.遼寧中醫藥大學 藥學院，遼寧 大連116600；2.中國人民解放軍沈陽軍區總醫院，遼寧 沈陽 110016)

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腎病患者血漿代謝組學分析前樣品處理方法優化

趙 靜1，關 欣2，包永睿1，王 帥1，孟憲生1*，鄭紅光2*

(1.遼寧中醫藥大學 藥學院，遼寧 大連116600；2.中國人民解放軍沈陽軍區總醫院，遼寧 沈陽 110016)

目的：對代謝組學分析前慢性腎病患者血漿樣品的處理方法進行優化。方法：采用HPLC/TOF-MS技術分別對60例慢性腎病患者及30例健康志愿者的血漿處理方法進行優化研究。結果：實驗結果顯示，采用甲醇沉淀蛋白質對慢性腎病患者及健康人血漿均可達到較好的除蛋白效果，并且可最大限度地保留血漿中的待測組分；用80%乙腈作為復溶溶劑可最大限度地保留血漿中的待測組分。結論：建立了采用HPLC/TOF-MS技術對代謝組學分析前樣品進行處理優化的方法，為研究慢性腎病患者血漿代謝組學奠定基礎。

慢性腎病；血漿；液質聯用；樣品處理

慢性腎病是指由各種病因使腎單位發生進行性破壞，不能充分排出代謝廢物和維持內環境穩定，導致體內出現代謝廢物潴留及水、電解質與酸堿平衡紊亂，并伴有尿量和尿質改變以及腎臟內分泌功能障礙的疾病。代謝組學是通過比較對照組和實驗組代謝物的不同，以尋找其代謝譜差異的一種研究方法。通過對由疾病誘導產生的代謝產物變化進行分析，可幫助了解病變過程和機體內代謝途徑[1-2]，尋找新的疾病生物標志物，同時輔助臨床診斷和治療。

在代謝組學研究過程中，樣品前處理環節是至關重要的，影響診斷結果的可靠性和準確性。在樣品制備過程中，在保證實驗數據真實、可靠的基礎上，需要在樣品前處理時盡量除去其含有的蛋白質并最大限度地保留全部樣品信息。本實驗在液質聯用的基礎上，建立慢性腎病血漿樣本處理條件的考察方法，并首次使用Agilent MPP12.1軟件的MFE功能進行化合物提取，以化合物提取數量為考察指標，為今后運用代謝組學方法探討慢性腎病患者與健康人血漿代謝差異物，并根據代謝物的不同指導慢性腎病的臨床用藥奠定基礎。

1 研究對象

所選病例主要來源于沈陽軍區總醫院已獲知情同意的門診及住院患者，正常對照組為來自沈陽軍區總醫院的健康自愿者。其中慢性腎病患者血漿樣本60例，正常人血漿樣本30例。

2 儀器與試劑

2.1 儀器

高效液相色譜儀(Agilent1100，配有DAD檢測器及自動進樣器)，QF3800氮氣吹干儀(北京華盛譜信儀器有限責任公司)，H1650-W離心機(湖南湘儀實驗儀器開發有限公司)，TDZ4-WS低速臺式離心機(湖南湘儀實驗儀器開發有限公司)，-80℃低溫冰箱(NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC公司)，Milli-Q超純水系統(Millipore，France)，20～200μL和200～1 000μL移液槍(法國吉爾森公司)，TOF-MS(Agilent TOF G1969A，配有ESI電離源接口)，VORTEX-5渦旋混合器(海門市其林爾儀器制造有限公司)。

2.2 試劑

色譜級乙腈、甲醇(德國Merck公司)，色譜級甲酸(天津市科密歐化學試劑有限公司)，超純水(18.2 MΩ) 由本實驗室Milli-Q超純水系統(Millipore，France)制備，其他試劑均為分析純。

3 方法與結果

3.1 色譜條件

色譜柱為Agilent Poroshell 120 SB-C18column(100mm×4.6mm，2.7μm)，流速為1mL·min-1，分流比為3∶1，柱溫為45 ℃，流動相為A：0.1 %甲酸水溶液，B：乙腈，梯度洗脫條件見表1。進樣量為4μL，進樣高度為4mm。

3.2 質譜條件

電噴霧離子源(Dual ESI)，采用正離子模式檢測。用350℃氣體干燥，流速為9L·min-1；毛細管電壓為4 000V，霧化器壓力為45psig，Skimmer 為65V；碎裂電壓為125V，OCT 1RF Vpp為250V；采用質心模式采集，速率為1.5Spectra/s，m/z50～1050；采用校正混合溶液(Agilent，USA，m/z=121.050 873，922.009 798)作為鎖定質量(Lock mass)。

表1 梯度洗脫條件

3.3 血漿樣品處理方法優化

3.3.1 沉淀蛋白溶劑考察 LC-MS進樣前，要除去樣品中含有的蛋白質，不同溶劑對蛋白質的去除效果有所不同，沉淀蛋白質的同時還要盡量保存組分中的其他物質，并且使之能充分地溶解在溶劑中。

(1)混合血漿制備：分別精密吸取慢性腎病患者及健康人所有血漿樣本各100μL于樣品管中，混勻，備用。

(2) 供試品溶液制備：分別精密吸取100μL混合血漿樣品各10份于2mL離心管中，分別精密加入60%、70%、80%、90%、100%乙腈和60%、70%、80%、90%、100%甲醇各400μL，渦旋3min，4 ℃下15 000 r·min-1離心15min，用移液槍吸取上層清液，采用氮氣吹干儀吹干后分別精密加入相應提取溶劑各100μL，備用。

實驗結果顯示，采用甲醇沉淀蛋白質可達到較好的除蛋白效果，并且可最大限度地保留血漿中的待測組分，結果見表2。

3.3.2 復溶溶劑考察 血漿溶液經蛋白沉淀后，吸取上層清液，氮氣吹干后需再進行復溶。復溶溶劑極性的大小是影響被提取成分是否能夠完全溶解的關鍵因素，假設甲醇沉淀血漿中蛋白質時，血漿含水量以100%計，100μL血漿加入甲醇400μL，相當于蛋白質沉淀溶劑為80%甲醇，為保證樣品能完全溶解，現對樣品復溶溶劑進行考察。

精密吸取100μL混合血漿樣品10份于2mL離心管中，分別精密加入甲醇400μL，渦旋3min，4℃下15 000r·min-1離心1min，用移液槍吸取上層清液，氮氣吹干儀吹干后，分別精密加入60%、70%、80%、90%、100%乙腈和60%、70%、80%、90%、100%甲醇各100μL。實驗結果顯示，以80%乙腈作為復溶溶劑可最大限度地保留血漿中的待測組分，結果見表3。

表2 沉淀蛋白質溶劑用量考察結果 (μL)

表3 復溶溶劑用量考察結果 (μL)

3.3.3 凍融穩定性考察 對同一份血漿樣品分別進行凍融1、2和3次處理，每組重復處理兩次，考察凍融循環后樣品的穩定性，標記為1～6，樣品處理方法如上。經過不同冷凍循環處理后的樣品，測定其所含化合物數量，并計算RSD值，均小于15%。結果表明，樣品經不同凍融循環后，不會引起統計學上的差異，樣品凍融穩定性良好。

3.3.4 重復性考察 分別精密吸取慢性腎病及健康人血漿樣品各6份，每份各100μL，精密加入甲醇400μL，渦旋3min，4℃下15 000r·min-1離心15min，用移液槍吸取上層清液，氮氣吹干儀吹干后，精密加入80%乙腈100μL，渦旋3min，4℃下15 000 r·min-1離心15min，吸取上清，即得樣品溶液。測定所含化合物數量，并計算RSD值，均小于15%，結果見圖1和圖2。結果表明，該血漿樣品處理方法重復性良好，可用于腎病血漿代謝組學研究。

圖1 慢性腎病患者血漿HPLC-TOFMS總離子流

圖2 健康人血漿HPLC-TOFMS總離子流

4 結論

在代謝組學研究中，樣品制備過程必須要遵循以下幾項原則：首先要盡量簡化處理步驟以使樣品中蛋白質被完全除去，并能達到各組分相互分離的效果；在保證樣品各組分相對濃度穩定的同時盡可能避免樣品中待測物流失；處理方法應具有良好的重復性。因此本實驗設法在分析樣品前將血漿中的蛋白質盡可能地除去，再對其進行LC-MS分析。在沉淀蛋白質的同時，要最大限度地保留血漿中的小分子化合物，使其充分溶解在有機溶劑中，盡量減少待分析組分因蛋白沉淀而造成損失。沉淀蛋白質的過程尤為重要，需對沉淀溶劑進行考察。本研究對代謝組學實驗血漿樣品的制備方法及其測定條件進行了選擇和優化，得到全面精確、可靠的實驗數據。

本研究對血漿前處理方法的沉淀溶劑及復溶溶劑進行了考察，結果表明該方法有效、可行。實驗結果顯示，采用甲醇沉淀蛋白質對慢性腎病患者及健康人血漿均可達到較好的除蛋白效果，并且可最大限度地保留血漿中的待測組分；用80%乙腈作為復溶溶劑可最大限度地保留血漿中的待測組分。此外，對凍融穩定性及重復性進行考察時發現，在3次凍融循環之內，提取的化合物數量沒有統計學差異，表明凍融穩定性效果良好；分別對慢性腎病組及健康組患者血漿樣品進行重復性考察，結果顯示該方法重復性良好。

綜上所述，該方法操作簡單，盡可能保留了血漿樣品中的小分子化合物，符合代謝組學高通量研究的基本要求。在尋找慢性腎病患者與健康人血漿中差異物的基礎上，進一步探討慢性腎病患者的發病機制，為今后臨床治療慢性腎病奠定基礎。

[1] TAYLOR J,KING R,FIEHIN O.Application of metabolomics to plant genotype discrimination using statistics and machine learning[J].Bioinformatics,2002,18(10):S241-S248.

[2] CHEN JING,LU XIN,XU GUOWANG,et al.A metabonomics approach based on liquid chromatography-mass spectrometry:from metabolic profiling to potential biomarker[J].Science in China Series B Chemistry,2009,39(17):1268-1276.

(責任編輯：尹晨茹)

Optimization of Disposal Method of Treated Plasma Samples Before Analysis of Metabolism in Chronic Kidney Disease Patients

Zhao Jing1,Guan Xin2,Bao Yongrui1,Wang Shuai1,Meng Xiansheng1*,Zheng Hongguang2，*

(1.Pharmaceatic of Liaoning Univresity of Traditional Chinese Medicine, Dalian 116600,China;2.General Hospital of Shenyang Military Region of PLA,Shenyang 110016,China)

Objective:Patients with chronic kidney disease on plasma sample preparation method metabolomics analysis before optimization.Methods:HPLC/TOF-MS technology for 60 cases of patients with chronic kidney disease and 30 healthy volunteers plasma research.Results:Experi-mental results show that the protein precipitation with methanol,chronic kidney disease patients and healthy addition to human plasma proteins can achieve better results， and can maximize the retention of analytes in plasma,with 80% acetonitrile as a solvent reconstitution can be plasma maximize the retention of analytes.Conclusion:the established for metabonomics optimization method for sample treatment before analysis using HPLC/TOF-MS technology.To lay the foundation for the study of plasma metabonomics．

Chronic Kidney Disease; Plasma; LC-MS;Sample Preparation

2014-09-10

趙靜(1988-)，女，遼寧中醫藥大學碩士研究生，研究方向為藥物分析及慢性腎病代謝組學。

孟憲生，男，博士，遼寧中醫藥大學教授，研究方向為中藥質量分析，E-mail:mxsvvv@126.com；鄭紅光，男，博士，中國人民解放軍沈陽軍區總醫院主任醫師，研究方向為腎病臨床診療，E-mail:phd528@163.com。

Q936

A

1673-2197(2015)02-0031-03

10.11954/ytctyy.201502012