脂多糖誘導的急性肺損傷模型建立

馮 旭，郭 蕊，梁臣艷，吳 玲，李 盼

(廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530001)

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脂多糖誘導的急性肺損傷模型建立

馮 旭，郭 蕊，梁臣艷*，吳 玲，李 盼

(廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530001)

目的：建立脂多糖誘導的急性肺損傷模型。方法：隨機將60只昆明種小鼠分為5組，分別向小鼠尾靜脈注射生理鹽水和不同劑量的脂多糖，12h后檢查并評估各組小鼠的急性肺損傷情況，以確定合適的建模脂多糖劑量。確定合適的脂多糖劑量后，采用ELISA法分別于2、6、12h末摘取小鼠眼球取血并分離血清，測定血清中hs-CRP、IL-1β、TNF-α水平；采用HE染色觀察小鼠肺臟病理形態變化。結果：脂多糖劑量為4mg/kg時，小鼠血清hs-CRP、IL-1β、TNF-α可持續保持較高水平。HE染色后，AIL組小鼠光鏡下可見以肺泡正常結構消失、肺泡間隔明顯增厚、肺泡腔內出血、大量炎性細胞浸潤為主要表現的組織病理變化，肺損傷6h最為明顯。結論：向小鼠尾靜脈注射脂多糖4mg/kg可成功復制AIL小鼠動物模型。

脂多糖；急性肺損傷；動物模型

急性肺損傷(ALI)是指由心源性因素以外的各種肺內外致病因素導致的急性、進行性缺氧性呼吸衰竭，以肺部容積減少、肺順應性降低、通氣/血流比例失調為病理特征，肺部影像學表現為非均一性滲出性病變，主要臨床癥狀為進行性低氧血癥和呼吸窘迫[1]。ALI發展至嚴重階段被稱為急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)。近年來，ALI/ARDS的發病率逐年升高，且死亡率高達30%～40%[2]。內毒素是G-細菌細胞壁的重要成分，又名脂多糖。當細菌死亡溶解或被人工破壞時，其可被釋放到細胞外，對宿主產生毒性效應[3]。大量炎癥細胞參與了機體炎癥反應，其中中性粒細胞(PMN)是導致細胞損害和肺組織損傷的主要效應細胞，也是造成過度性、失控性炎癥反應的主要因素。炎癥介質是參與和介導炎癥反應的化學因子，其中超敏C反應蛋白(hs-CRP)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素1β(IL-1β)等是重要的細胞炎癥介質，是研究表征炎癥是否存在以及嚴重程度的重要指標，已成為臨床測試是否有炎癥存在及其嚴重程度的通用指標[4-6]。

1 材料與試劑

1.1 動物

健康昆明小鼠，體重(18.0±2.0)g，雄性，由廣西醫科大學實驗動物中心提供 (合格證號：SCXK桂2009-0002)。

1.2 試劑

大腸桿菌脂多糖(批號：1010A032，美國Sigma公司)；無菌生理鹽水(批號：A12061505，廣西裕源藥業有限公司)；多聚甲醛(批號：20100626，天津市博迪化工有限公司)；小鼠hs-CRP ELISA試劑盒(批號：201010，美國 R&D 公司)；小鼠TNF-α ELISA試劑盒(批號：201010，美國R&D公司)； 小鼠IL-1βELISA 試劑盒(批號：201010，美國 R&D 公司)。其余試劑均為分析純。

1.3 儀器

電熱恒溫培養箱(型號：HHBII，上海躍進醫療器械廠)；電熱恒溫鼓風干燥箱(型號：101-1-BS，上海躍進醫療器械廠)；高壓自動滅菌器(型號：MLS-3750，日本三洋公司)；低溫高速離心機(型號：ST16R，美國熱電公司)；冰箱(型號：BCD-192DC，青島海爾公司)；全波長酶標儀(型號：Epoch，美國伯騰儀器有限公司)。

2 方法

2.1 脂多糖溶液配制

將適量LPS溶于生理鹽水中配制成500μg/mL的溶液，臨用現配，剩余溶液暫放 4℃ 冰箱內儲存，儲存時間不超過24h。

2.2 4%多聚甲醛溶液配制

精確稱取40g多聚甲醛，加入pH7.4 PBS溶液800mL，磁力攪拌器攪拌加熱至60℃，滴加NaOH溶液，完全溶解后，冷卻定容至1L，4℃儲藏備用。

2.3 小鼠尾靜脈注射脂多糖劑量確定

2.3.1 動物分組與處理 選擇健康昆明種小鼠50只，按照LPS劑量(1、2、3、4 及5mg/kg)分為5組，各組小鼠尾靜脈注射相應劑量的脂多糖，另選擇10只小鼠作為對照組，采用等體積無菌生理鹽水以同樣方法尾靜脈注射。摘取小鼠眼球取血，室溫下血液自然凝固30min后，于4℃下3 000r·min-1離心20min，分離血清，分裝凍存于-20℃。采用ELISA法檢測血清中hs-CRP、IL-1β、TNF-α含量。隨后摘取小鼠左肺上葉，以4%多聚甲醛溶液固定，常規石蠟切片，HE染色后進行病理組織鏡檢。

2.3.2 血清 hs-CRP、IL-1β、TNF-α檢測 分別采用hs-CRP、IL-1β、TNF-α的ELISA檢測試劑盒，按照說明書操作。

2.4 尾靜脈注射脂多糖誘導小鼠急性肺損傷的時間效應

2.4.1 動物分組與處理 取雄性小鼠40只，隨機分為空白對照組(空白組)，不同給藥時間組(2、6、12h)ALI組，每組10只。根據小鼠體重尾靜脈注射 LPS 4mg/kg，并于給藥2、6、12h后取樣，空白組小鼠尾靜脈注射等體積無菌生理鹽水，于2、6、12h后取樣。

2.4.2 動物標本采集 ALI各組小鼠注射LPS后，于 2、6、12h 末摘取小鼠眼球取血，室溫下血液自然凝固30min后，于4℃下 3 000r·min-1離心20min，血清分離后分裝，-20℃凍存。采用ELISA法檢測血清中hs-CRP、IL-1β、TNF-α含量。摘取小鼠左肺上葉，置于4%中性甲醛溶液中固定24h，常規脫水石蠟包埋，制作切片，厚度為5μm，伊紅染色(HE 染色)。

2.4.3 血清hs-CRP、L-1β、TNF-α檢測 操作同“2.3.2”。

2.5 觀察指標

在實驗期間，即從開始進行尾靜脈注射至實驗結束為止，觀察各組小鼠的一般狀態和大體標本。

2.6 檢測方法

取處理好的動物標本，于光鏡下觀察病理組織的形態變化。肺損傷評價指標為肺泡和間隙水腫程度、中性粒細胞浸潤程度以及出血程度。設置的評估標準[22]為(視野里)：無損傷=0；25%損傷=1；50%損傷=2；75%損傷=3；全都損傷=4。

2.7 統計學方法

3 結果

3.1 小鼠一般狀態和大體標本觀察

對照組小鼠呼吸平穩，進食正常，對外界刺激反應無異常，無死亡；肺葉外觀無異常，質軟，彈性好，呈粉紅色。脂多糖各劑量組小鼠精神萎靡，活動減少、食欲下降、呼吸急促，四肢、口唇發紺。脂多糖劑量達到4mg/kg后，小鼠肺臟可見明顯淤血點、出血點和水腫，尤以6h組最為明顯。

3.2 各劑量組小鼠血清L-1β、TNF-α及hs-CRP水平比較

尾靜脈注射LPS后，小鼠血清中炎癥細胞因子hs-CRP、IL-1β、TNF-α 水平均明顯升高，LPS1組、LPS2組、LPS3組小鼠血清hs-CRP、TNF-α水平與空白對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)；LPS4組、LPS5組小鼠血清hs-CRP、IL-1β、TNF-α水平顯著高于空白組，差異具有統計學意義(P<0.01)。見表1。

3.3 時間效應的血清hs-CRP、IL-1β、TNF-α水平比較

尾靜脈注射 LPS 后，ALI 組小鼠血清炎性細胞因子IL-1β、TNF-α、hs-CRP水平均明顯增加且顯著高于空白組，與空白組比較差異均有統計學意義(2h組vs空白組、6h組vs空白組、12h組vs空白組P均<0.01)。隨著時間的延長，小鼠血清 hs-CRP水平呈逐漸上升趨勢；血清TNF-α水平經LPS處理2h后達到高峰，6h時有所降低；血清IL-1β水平2h時達到高峰，6h時IL-1β水平有所降低，但仍高于空白組。結果見表2與圖1。

3.4 水平劑量的肺組織病理學評分比較

染色HE結果顯示，空白組小鼠無明顯炎癥反應。對照組小鼠尾靜脈注射LPS后， LPS3、LPS4、LPS5劑量均可引起小鼠肺組織充血、水腫及炎癥細胞浸潤，與空白組比較差異具有統計學意義(P<0.01)。LPS3組小鼠肺臟HE染色鏡檢中僅見輕度炎癥細胞浸潤，炎癥反應輕微；LPS4組小鼠肺臟可見炎癥細胞輕到中度浸潤，伴有組織淤血水腫，水腫程度不等，炎癥反應較明顯；LPS5組小鼠可見大量炎癥細胞浸潤，并伴有淤血。LPS1組、LPS2組小鼠肺組織病理學表現與空白組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

組別劑量(mg/kg)hs-CRP(mg/L)TNF-α(ng/L)IL-1β(ng/L)空白組-24.03±1.19228.04±22.5457.55±3.40LPS1124.55±1.27262.56±28.6370.31±3.94▲▲LPS2225.21±1.34248.10±31.0173.75±6.745▲▲LPS3325.36±1.08253.88±32.5369.87±6.00▲▲LPS4425.91±0.78▲▲268.99±33.85▲76.13±5.20▲▲LPS5527.25±2.07▲▲290.47±58.35▲▲83.11±13.29▲▲

組別hs-CRP(μg/L)TNF-α(ng/L)IL-1β(ng/L)空白組4.07±0.49416.27±49.2739.42±9.39LPS2h5.34±0.92▲▲582.08±70.98▲▲76.18±7.45▲▲LPS6h5.89±0.81▲▲561.96±71.94▲▲65.75±10.88▲▲LPS12h6.29±0.97▲▲528.45±64.16▲▲58.59±10.15▲▲

圖1 各組小鼠血清hs-CRP、TNF-α、IL-1β水平比較

表3 水平劑量的肺部炎癥組織病理學評分比較

3.5 時間效應的肺組織病理學評分比較

染色HE結果顯示，空白組小鼠無明顯炎癥反應。對照組小鼠肺組織在光鏡下發生病理學改變，可見肺泡間隔增寬，部分肺泡塌陷，內浸潤有較多數量的中性粒細胞，明顯充血，中性粒細胞浸潤程度與出血程度均顯著高于空白組，差異具有統計學意義(P<0.01)，以6h最為顯著，12h次之，2h最弱。見表4。

組別給藥劑量(mg/kg)炎癥評分空白組-0.50±0.53LPS2h42.60±0.70▲▲LPS6h43.20±0.63▲▲LPS12h42.00±0.67▲▲

4 討論

本研究設置了不同劑量的LPS(1、2、3、4、5mg/kg) ，旨在確定復制小鼠ALI模型的最佳條件，通過測定血清中炎癥細胞因子的水平和病理變化，綜合評價ALI模型是否成功建立。從實驗結果可知，不同劑量的脂多糖可引起不同程度的ALI：當LPS≥4mg/kg時，小鼠出現明顯的呼吸困難、四肢、口唇發紺等癥狀，血清中TNF-α、IL-1β、hs-CRP水平均顯著升高，出現炎癥細胞浸潤與組織瘀血水腫等病理學變化。該變化與ALI病程發展過程相似，說明當LPS≥4mg/kg時，可顯著引發小鼠釋放抗炎因子。當LPS劑量為5mg/kg時，可導致小鼠死亡現象，因此4mg/kg LPS為建立小鼠急性肺損傷模型的安全劑量。

本實驗采用小鼠制備急性肺損傷模型，尾靜脈注射LPS 4mg/kg后，對3個時間點的小鼠血清促炎因子hs-CRP、TNF-α、IL-1β水平以及肺損傷程度進行檢測，初步探討肺損傷過程中炎性介質的相互關系及其變化規律。病理結果顯示，空白組小鼠肺組織形態結構變化不明顯，小鼠在注射LPS 2h后出現肺損傷，損傷程度隨時間變化，6h時損傷最明顯，表現為肺泡間隔明顯增厚，部分肺泡塌陷，大量中性粒細胞浸潤，明顯充血；但至12h時，病理變化又趨向減輕。實驗結果表明，LPS注射6h時小鼠出現明顯的肺組織結構損傷，證實ALI模型復制成功。

綜上所述，從開始進行尾靜脈注射至觀察終點為止，各組小鼠全部存活，表明4mg/kg劑量的 LPS 安全性較高，用于靜脈注射建模安全性良好，且病理學改變以6h時最為顯著。

[1] 錢桂生.急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合征研究現狀與展望[J].解放軍醫學雜志,2003,28(2):97-101.

[2] 繆李麗,駱玲,王導新.Ang-2在大鼠內毒素性急性肺損傷中的作用[J].細胞與分子免疫學雜志,2009,25(11):1005.

[3] 張霞,剡根強,王靜梅.細菌內毒素的研究概況[J].上海畜牧獸醫通訊, 2006(4):4-5.

[4] KANEHARA M,YOKOYAMA A,TOMODA Y,et al. Anti-inflammatory effects and clinical efficacy of theophylline and tulobuterol in mild-to-moderate chronic obstructive pulmonary disease[J]. Pulmonary pharmacology & therapeutics,2008,21(6):874-878.

[5] WITONSKI D,WAGROWSKA-DANILEWICZ M,KESKA R,et al. Increased interleukin 6 and tumour necrosis factor alpha expression in the infrapatellar fat pad of the knee joint with the anterior knee pain syndrome: a preliminary report[J]. Polish Journal of Pathology, 2010,61(4):213-218.

[6] SUHWM, PARK SB, LEE S,et al. Suppression of mast-cell-mediated allergic inflammation by Lindera obtusiloba[J]. Experimental biology and medicine,2011,236(2):240-246.

(責任編輯：尹晨茹)

Establishment of Animal Model of Acute Lung Injury in Mice Induced by Lipopolysacharide

Feng Xu,Guo Rui,Liang Chenyan*,Wu Ling,Li Pan

(Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530001,China)

Objective:To establish acute lung injury(ALI) model induced by liPopolysaccharide in mice. Methods:Kun-ming mice were injected respectively with isometric stroke-physiological saline solution and LPS, An evaluation on acute lung injury was been executed at the end of 12h to confirmed anappropriate LPS dose for establishing mice model. The mice were culled eye ball after injected proper dose of LPS for 2h, 6h, 12h. The levels of serum high-sensitivity C-reactive protein (hs-CRP), tumor necrosis factor alpha (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β) and were detected by enzyme-linked immunosorbent assay. Regular HE staining was applied to evaluate the inflammatory reaction of lung tissue. Results:The level of mice serum IL-1β,TNF-α and hs-CRP were raised after injection of LPS 4mg/kg. By microscopy, the lung tissue strueture of mices in ALI group were damaged, a large mount of neutrophil recruitment and the thiekened interalveolar septum with signifieantly hyperemia in lung tissue of the LPS group. Such changes listed above appeared most severely at the time Point of 6h after the injection of LPS. The ALI pathological score of the mices of the LPS group was higher than that of NS group. Conclusion:The ALI mice model could be duplicated successfully infusing by injection of LPS 4mg/kg in caudal vein.

LPS; ALI; Animal Model

2015-03-27

國家自然科學基金(81060336)；廣西自然科學基金( 2011GXNSFF018006)；“八桂學者”工程專項經費

馮旭(1976-)，男，廣西中醫藥大學副教授，研究方向為中藥、民族藥有效成分和質量控制。

梁臣艷，女，廣西中醫藥大學副教授，碩士生導師，研究方向為中藥有效成分和質量控制。

R363

A

1673-2197(2015)14-0005-03

10.11954/ytctyy.201514003