白藜蘆醇通過調節iNOS抑制C57BL/6J小鼠動脈粥樣硬化的機制探討*

秦　麗，關　莉，林銳珊，薛倩倩，徐進文，閆福曼，李小英，劉海梅△(廣州中醫藥大學基礎醫學院生理學教研室，西醫基礎公共實驗室，廣東廣州50006)

白藜蘆醇通過調節iNOS抑制C57BL/6J小鼠動脈粥樣硬化的機制探討*

秦麗1，關莉1，林銳珊2，薛倩倩1，徐進文1，閆福曼1，李小英1，劉海梅1△
(廣州中醫藥大學基礎醫學院1生理學教研室，2西醫基礎公共實驗室，廣東廣州510006)

［摘要］目的:探討白藜蘆醇(resveratrol，RES)對卵巢切除小鼠血脂四項總膽固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)以及血清一氧化氮(nitric oxide，NO)含量、胸主動脈的過氧亞硝基陰離子(peroxynitrite anion，ONOO(－))及誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)蛋白表達水平的影響。方法:雌性C57小鼠經卵巢切除建立去勢模型后，分為假手術組、單純去勢組、假手術高脂組、模型高脂組和RES組。單純去勢組和假手術組給予普通飼料，其余給予高脂飼料。14周后，收集血清檢測各組血清的CHOL、TG、LDL-C和HDL-C水平，硝酸還原酶法測血漿NO水平，油紅O染色觀察動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)情況，DAB染色測定血管ONOO(－)及iNOS水平，免疫印跡測定血管組織的iNOS表達。結果:模型高脂組血清CHOL、TG、LDL-C和NO較正常對照組升高(P＜0.05) ;與模型高脂組相比，RES組可降低小鼠血清的TC、TG、LDL-C和NO(P＜0.05) ; 14周后，AS模型成功建立，模型高脂組有明顯的AS病理改變，單純去勢組無明顯AS斑塊，RES組AS病變明顯減輕;高脂喂養14周后，模型高脂組血管組織的iNOS及ONOO(–)表達也較正常對照組明顯提高(P＜0.05) ;與模型高脂組相比，RES組可降低小鼠胸主動脈的iNOS表達(P＜0.05)，與此同時，血管ONOO(－)含量較模型高脂組降低。結論: RES可以抑制iNOS表達，減少NO生成，防治動脈粥樣硬化。

［關鍵詞］白藜蘆醇;動脈粥樣硬化;一氧化氮;誘導型一氧化氮合酶

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種炎癥性疾病，外源性因素如低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)、高血壓、糖尿病、吸煙等引起的自由基增多，損害內皮，導致內皮功能障礙、單核細胞轉化為巨噬細胞、白細胞黏附聚集、淋巴細胞激活等，在局部釋放血管活性物質、細胞因子、生長因子和促凝因子等，誘發炎性反應，并刺激誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)蛋白合成增加，一氧化氮(nitric oxide，NO)分泌增多，進一步加重AS。研究發現白藜蘆醇(resveratrol，RES)具有潛在的抗AS作用，但其機制尚不明確，本研究用C57BL/6J小鼠建立卵巢切除模型，試圖闡明白藜蘆醇、iNOS、NO和AS之間的關系。

材料和方法

1實驗動物

雌性C57BL/6J小鼠60只，體質量18～22 g，購于廣東省實驗動物中心，合格證號為No.0004089。

2藥物、試劑和主要儀器

RES購自Aladdin; iNOS抗體和nitrotyrosine抗體購自Abcam; GAPDH抗體購自Sigma; SABC試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司; DAB顯色試劑盒購自中杉金橋; NO試劑盒購自南京建成生物工程研究所，其它試劑均為國產分析純。

冰凍切片機(Leica) ; Olympus顯微鏡和ImageJ圖像分析軟件;冰凍離心機(湖南赫西儀器裝備有限公司) ;酶標儀(Bio-Rad)。

3方法

3.1分組和制備去勢模型60只雌性小鼠適應性喂養5 d，隨機分為6組，即假手術(sham)組、假手術高脂(high fat，HF)組(sham+ HF組)、卵巢切除術(ovariectomy，OVX)組、模型高脂(OVX+ HF)組和RES組。OVX組、OVX+ HF組和RES組均手術去勢，摘除雙側卵巢［1］。手術前禁食12 h，以10%的水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉后，仰面固定，剔除下腹部長毛，用體積分數75%乙醇消毒手術區域，經下腹部正中開一切口約2 cm，依次切開皮膚，皮下組織，腹白線等，找到子宮，之后沿著子宮末端找到卵巢，結扎后切除卵巢組織，并縫合皮下及皮膚層［2］。其余組進行假手術操作，在切開腹壁后找到輸卵管切除部分脂肪后縫合。

3.2分組和給藥腹腔術后正常飲食7 d后開始給藥。RES組: 10只小鼠，以15 g/L的RES 0.2 mL/d灌胃，高脂飲食; sham組和OVX組:等容積的生理鹽水灌胃，普通飲食; OVX+ HF組和sham+ HF組:等容積的生理鹽水灌胃，高脂飲食。干預14周。

3.3血清的采集及血脂的測量實驗14周末禁食12 h，摘眼球取血約0.5～1 mL，靜置后離心分離血清，生化分析儀檢測血脂4項總膽固醇CHOL、三酰甘油TG、低密度脂蛋白膽固醇LDL-C、高密度脂蛋白膽固醇HDL-C。

3.4血漿中NO水平的檢測實驗14周末，采取眼球取血。將血樣本在3 000 r/min離心15 min，用硝酸還原酶法測定NO水平。

3.5胸主動脈油紅染色實驗14周末取血后小鼠頸椎脫臼法處死，立即取出胸主動脈血管做常規冰凍切片，片厚10 μm，晾干存放在－80℃。用時各組取出1張切片，室溫晾干，配置好油紅工作液過濾，將配好的油紅滴加在組織上10 min，用濾紙吸干周邊的油紅，將切片放在60%的異丙醇中，待背景變無色后取出(顯微鏡下觀察)，稍微晾干，滴加蘇木素溶液(顯微鏡下見細胞核變藍色) 3 min，立即將切片置于自來水，流水洗10 min，取出切片甘油明膠封片，顯微鏡拍片。

3.6免疫組化檢測主動脈iNOS的表達胸主動脈經常規固定、脫水、包埋，每例標本均做厚度為10 μm的連續切片6～8張，進行染色。iNOS的蛋白表達測定采用DAB染色，參照試劑盒說明書進行。顯微鏡觀察并拍照，ImageJ進行半定量分析。

3.7各組小鼠胸主動脈ONOO－檢測冰凍切片進行DAB染色，使用nitrotyrosine抗體，過程參照試劑盒說明書進行。顯微鏡觀察并拍照，ImageJ進行半定量分析。

3.8Western blot檢測iNOS蛋白的表達RIPA法提取組織蛋白，以BCA法進行蛋白定量，用10% SDS-PAGE，轉至PVDF膜上。室溫下用5%脫脂奶粉封閉2 h，然后與iNOS和GAPDH相應抗體4℃孵育過夜，次日以TBST洗膜，再用相應的II抗(羊抗兔)室溫孵育1 h，洗膜后加化學發光劑暗室中曝光，膠片經顯影和定影，蛋白帶用凝膠圖像分析儀分析和定量。

4統計學處理

采用SPSS 13.0統計軟件進行統計分析，計量資料用均數±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用S-N-K法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1各組小鼠血脂水平的比較

各組小鼠之間的CHOL、HDL和LDL水平比較差異均無統計學意義; OVX+ HF組除HDL-C較正常組降低外，CHOL、TG和LDL-C均較正常對照組升高(P＜0.05) ;與OVX+ HF組相比，RES預處理后可明顯降低小鼠血清的CHOL、TG和LDL-C，升高HDL-C(P＜0.05)，見表1。

表1　各組小鼠血脂水平的比較Table 1.The levels of blood lipids in different groups (mmol/L.Mean±SD.n=6)

2各組小鼠血漿中的NO水平

高脂喂養14周后，OVX+ HF組血清NO含量較sham組明顯升高(P＜0.05)，與OVX+ HF組相比，RES可有效降低血清的NO含量(P＜0.05)，見圖1。

Figure 1.The effect of resveratrol on plasma NO content in different groups.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs OVX+ HF group.圖1白藜蘆醇對C57卵巢去勢小鼠血漿NO水平的影響

3各組油紅染色觀察

高脂喂養14周后，sham組血管結構清晰可見，內膜連續完整而光滑; OVX+ HF組的內膜有較明顯的脂質斑塊，內膜明顯增厚; RES組內膜增厚程度均較輕，脂質斑塊也明顯減少。半定量分析后可見RES組平均光密度值較OVX+ HF組明顯降低(P＜0.05)，見圖2。結果顯示RES對小鼠的AS斑塊的形成有抑制作用。

4各組iNOS免疫組化染色觀察

高脂喂養14周后，胸主動脈切片進行DAB染色，結果顯示OVX+ HF組的iNOS表達相比sham組顯著增加，而RES組的iNOS表達量明顯低于OVX+ HF組。半定量分析結果顯示OVX+ HF組的平均吸光度顯著高于其它組，而RES組的平均吸光度則明顯降低(P＜0.05)，見圖3，說明RES能有效抑制血管內皮iNOS的表達，從而降低NO的生成。

Figure 2.The structure and average absorbance of the aorta in C57BL/6J mice with Oil Red O staining (×20).Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs OVX+ HF group.圖2油紅染色顯示C57BL/6J小鼠胸主動脈結構和油紅染色的半定量分析

Figure 3.The effect of resveratrol on expression of iNOS in the thoracic aorta in different groups (×20).Mean±SD.n=4.*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs OVX+ HF group.圖3免疫組織化學染色分析主動脈iNOS的表達

5胸主動脈ONOO－的檢測

DAB染色圖像顯示OVX+ HF組的ONOO－含量顯著高于其它組，而RES組的ONOO－含量則較之大幅度減少。半定量分析顯示OVX+ HF組組的平均吸光度明顯高于其它組，而RES組的平均吸光度只有OVX+ HF組的1/2左右(P＜0.05)，見圖4，證明RES能有效地減少ONOO－。

Figure 4.The ONOO－production in the thoracic aorta in different groups (×20).Mean±SD.n=4.*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs OVX+ HF group.圖4血管ONOO－的DAB染色和半定量分析

6各組小鼠血管的iNOS表達

與對照組相比，OVX+ HF組的iNOS蛋白表達明顯增高，而RES灌胃后，可明顯降低iNOS在血管組織中的表達(P＜0.05)，提示RES能有效抑制iNOS在血管組織中的表達，從而降低NO的合成，見圖5。

討論

AS是一種嚴重危害人類健康的常見病，是冠心病、腦血管病和血栓栓塞性疾病等缺血性心腦血管病的主要病理基礎［3-4］。大量的基礎和臨床研究表明，AS的危險因素包括高脂血癥、高血壓、高血糖(糖尿病)、高纖維蛋白原血癥，肥胖、腎素-血管緊張素-醛固酮系統活化、吸煙，NO等自體生物活性物質代謝紊亂等因素［5-6］。到目前為止，AS的發病機制尚未完全清楚，存在多種學說，涉及多種危險因素［7］。

Figure 5.The effect of resveratrol on the protein expression of iNOS in the thoracic aorta of different groups.Mean± SD.n=4.*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs OVX+ HF group.圖5 Western blot檢測C57小鼠胸主動脈的iNOS表達

AS發生、發展中，高脂血癥所造成的動脈內皮功能損害起關鍵作用，這種損害可能的原因是內皮細胞NO代謝的異常。NO廣泛存在于各種組織和細胞中，是一種重要的生物活性分子。NOS能夠催化L-精氨酸生成L-瓜氨酸和NO，現己發現的NOS類型包括神經元型NOS(neuronal NOS，nNOS)、iNOS和內皮型NOS(endothelial NOS，eNOS)。在動脈血管壁組織中與AS相關聯的主要是eNOS和iNOS。在正常生理狀態下，NO是由內皮細胞產生的eNOS催化產生的，血管中缺乏iNOS。但在某些炎癥介質的刺激下，血管中的iNOS可能被誘導表達，產生大量的超出生理濃度的NO，這些過量的NO可能反而引起血管功能障礙，對機體造成損害［8］。因此，NO 在AS的發病中具有雙重作用［9］。大量NO與氧自由基可迅速反應生成氧化活性更高的ONOO－，比NO對細胞具有更大的損傷性［10］，從而促進動脈粥樣硬化的形成。我們的實驗結果顯示，與正常對照組相比，模型組有明顯的高脂血癥，iNOS表達顯著升高，產生大量的NO，有明顯的斑塊形成。

RES是一類目前尚未發現毒副作用的植物雌激素，作用類似于雌激素，但更有優勢及其潛力，主要存在于虎杖、藜蘆、葡萄等植物中，具有一定的抗AS作用［11］。已有相關研究顯示RES可明顯降低高脂飲食大鼠血清的LDL、甘油三酯、膽固醇含量，降低動脈硬化指數［12］。邊寧等［13］報道高脂對照組大鼠血清iNOS表達顯著增加，產生大量NO，給予RES大鼠血清iNOS表達明顯減少，血脂顯著降低，說明RES可糾正高脂血癥大鼠NO代謝紊亂，從而保護血管內皮細胞，對抗AS的發生和發展。也有報道RES具有酚羥基結構，具有很強的自由基清除能力［14］。Olas等［15］研究顯示RES可明顯抑制高濃度的ONOO－血漿介導的氧化反應，我們的實驗結果也表明白藜蘆醇組ONOO－生成明顯降低，NO含量減少，也證實了這一觀點。

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(責任編輯:林白霜，羅森)

Resveratrol regulates iNOS to inhibit atherosclerosis in C57BL/6J mice

QIN Li1，GUAN Li1，LIN Rui-shan2，XUE Qian-qian1，XU Jin-wen1，YAN Fu-man1，LI Xiao-ying1，LIU Hai-mei1
(1Department of Physiology，2Western Medicine Basis Public Laboratory，Basic Medical College，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006，China.E-mail: lhmei99@163.com)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the effect of resveratrol on the lipids (CHOL，TG，LDL-C and HDL-C)，nitric oxide (NO)，peroxynitrite anion (ONOO(－)) and the expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in the artery of the mice with ovariotomy (OVX).METHODS: The lipid levels and NO level in the serum were measured.The changes of atherosclerosis were evaluated with Oil Red O staining.The expression of iNOS was measured by DAB staining and Western blot.The ONOO(－)production was measured by DAB staining.RESULTS: Compared with sham group，the levels of the lipids and NO production in OVX+ high fat (HF) group were increased (P＜0.05).Compared with OVX+ HF group，the levels of the lipids and NO production in resveratrol group were decreased (P＜0.05).Fourteen weeks later，the atherosclerosis model was successfully established.Compared with OVX+ HF group，the iNOS expression and the ONOO(－)production in resveratrol group were decreased (P＜0.05)，while those in sham group were increased (P＜0.05).CONCLUSION: Resveratrol prevents and treats atherosclerosis by inhibiting the iNOS expression in C57BL/6J mice.

［KEY WORDS］Resveratrol; Atherosclerosis; Nitric oxide; Inducible nitric oxide synthase

通訊作者△Tel: 020-39358028; E-mail: lhmei99@163.com

*［基金項目］國家自然科學基金資助項目(No.81202186)

［收稿日期］2015-04-02［修回日期］2015-08-02

［文章編號］1000-4718(2015)09-1601-05

［中圖分類號］R363.1; R543

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.09.012