依普利酮對高鹽誘導的高血壓大鼠主動脈內皮型一氧化氮合酶表達及活性的影響*

張　倩，丁　菁，楊　飛，王勝男，粟　鳳，陸德琴(貴州醫科大學病理生理學教研室，貴州貴陽550025)

依普利酮對高鹽誘導的高血壓大鼠主動脈內皮型一氧化氮合酶表達及活性的影響*

張倩，丁菁，楊飛，王勝男，粟鳳，陸德琴△
(貴州醫科大學病理生理學教研室，貴州貴陽550025)

［摘要］目的:探討依普利酮對高鹽誘導的高血壓大鼠主動脈內皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表達及活性的影響。方法: 50～60 g 4周齡雄性Wistar大鼠隨機分為3組:對照(control，C)組用普通飼料飼養16周，高鹽飲食(high salt diet，HS)組及依普利酮(eplerenone，Epl)組用5%高鹽飼料飼養16周，C組和HS組于末4周給予同等劑量生理鹽水灌胃，而Epl組于末4周給予依普利酮40 mg· kg(－1)·d(－1)灌胃。每2周檢測各組大鼠尾動脈收縮壓，16周后處死大鼠，留取主動脈。ELISA法檢測醛固酮含量，蛋白免疫印跡法檢測鹽皮質激素受體(MR)及eNOS蛋白表達水平，化學比色法測定一氧化氮合酶活性，免疫組化染色法觀察主動脈eNOS、神經型一氧化氮合酶(nNOS)及MR蛋白表達與定位。結果: (1)高鹽飼料飼養8周后，大鼠收縮壓即明顯升高，并逐漸上升，16周時HS組收縮壓較同時點C組明顯升高(P＜0.05) ;依普利酮灌胃4周后，收縮壓比灌胃前明顯下降(P＜0.05)。(2)與C組比較，HS組、Epl組主動脈醛固酮含量明顯增加(P＜0.05)，且MR表達明顯增加(P＜0.05)。(3) HS組較C組eNOS蛋白表達減少(P＜0.05)、結構型一氧化氮合酶(cNOS)活性也降低(P＜0.05) ; Epl組較HS組eNOS蛋白表達增加(P＜0.05)、cNOS活性增高(P＜0.05)。結論: (1)高鹽誘導高血壓大鼠的主動脈醛固酮含量明顯增加，醛固酮可能通過激動MR降低主動脈eNOS蛋白表達及酶活性。(2)選擇性MR拮抗劑依普利酮可恢復eNOS蛋白表達及活性，改善eNOS功能。

［關鍵詞］高血壓;高鹽飲食;內皮型一氧化氮合酶;鹽皮質激素受體

［修回日期］2015-07-14

長期高鹽飲食是血壓升高的一個重要原因［1］。鹽敏感性高血壓的發生是多種機制共同作用的結果，包括遺傳機制、神經機制、內皮功能障礙機制、腎素血管緊張素醛固酮系統(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)機制等［2］。RAAS各組分及鹽皮質激素受體(mineralocorticoid receptor，MR)在心、腦、血管及腎臟等組織中都有表達［3］。易卒中自發性高血壓大鼠攝入高鹽后，腸系膜動脈組織醛固酮合酶基因表達增高［4］。血管內皮細胞長期暴露于醛固酮后，可造成一氧化氮合成減少，導致內皮功能障礙［5］。內皮細胞合成的內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)催化產生的一氧化氮具有擴張血管、調節血壓、抑制血管平滑肌細胞增殖等維持血管穩態的作用［6］。為探討高鹽性高血壓時動脈血管組織中醛固酮含量是否升高，選擇性MR拮抗劑對動脈內皮eNOS功能是否具有保護作用，本課題以高鹽誘導的高血壓大鼠為研究對象，觀察主動脈醛固酮含量的變化以及依普利酮(eplerenone，Epl)對eNOS表達水平及酶活性的影響。

材料和方法

1試劑

依普利酮購自大連美侖生物技術有限公司;兔抗鼠eNOS抗體、抗鼠微管蛋白β-tubulin抗體、抗鼠MR抗體及辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG均購自Santa Cruz;兔抗鼠nNOS抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司;大鼠醛固酮ELISA試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司;一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)活性測定試盒購自南京建成生物工程研究所。

2方法

2.1實驗動物及分組50～60 g 4周齡清潔級雄性Wistar大鼠，購自長沙市天勤生物技術有限公司，動物合格證號為SCXK(湘) 2009-0012。適應性喂養1周后隨機分為3組，每組21只。對照(control，C)組用嚙齒類動物粉末飼料自制成薄塊狀飼養16周，高鹽飲食(high-salt diet，HS)組用嚙齒類動物粉末飼料內加入5%食鹽后制成薄塊狀的飼料飼養16周，Epl組用嚙齒類動物粉末飼料內加入5%食鹽后制成薄塊狀的飼料飼養16周。于第13周開始，Epl組用依普利酮40 mg ·kg－1·d－1灌胃4周，其余2組用同等劑量生理鹽水灌胃4周。

2.2尾動脈無創血壓監測及高血壓的判定用成都泰盟BP-600A型大鼠無創血壓測量儀測定大鼠收縮壓。將套袖套在鼠尾根部，放入儀器內適應10 min～15 min后，自動充氣加壓測量。每次測量6個數值，取平均值為當天收縮壓值。因4周齡幼鼠尾動脈過細，無法測量血壓，故飼養4周后開始測量，每2周測量1次。凡收縮壓值≥115 mmHg，且比同時點C組收縮壓均值≥20 mmHg者，判定為高血壓［7］。

2.3主動脈采集大鼠處死前禁食10 h，3%戊巴比妥鈉(0.15 mL/100 g體質量)腹腔麻醉后快速剪取胸主動脈放入冰上預冷PBS中，迅速輕柔剔除血管外脂肪、結締組織后放入液氮中凍凝，置－70℃保存待用。

2.4主動脈醛固酮含量測定取出凍存的主動脈組織，在液氮中研磨至細粉末狀，轉移至已加入預冷PBS的離心管中，放入－70℃反復凍融2次破膜，離心后取上清檢測，操作步驟嚴格按照ELISA檢測試劑盒說明書完成。

2.5主動脈結構型NOS(constitutive NOS，cNOS)活性檢測取出凍存主動脈組織，在液氮中研磨后，置入預冷組織勻漿介質中，冰上裂解后離心取上清液檢測cNOS的活性，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書完成。

2.6Western blot檢測主動脈eNOS、MR蛋白的表達水平蛋白樣品制備后，行SDS-PAGE，再將蛋白轉印至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉后I抗(各抗體稀釋比例如下:兔抗鼠微管蛋白β-tubulin抗體為1∶1 000;兔抗鼠eNOS抗體為1∶800;兔抗鼠MR抗體為1∶400) 4℃孵育過夜。羊抗兔II抗(1∶5 000)孵育后，ECL顯影定影。電泳條帶用Bio-Rad凝膠圖像分析軟件分析，將各條帶積分光密度值分別與相應的β-tubulin條帶積分光密度值相比，以每次電泳的C組第1個樣品蛋白條帶的積分光密度值為100%，其余樣品蛋白條帶與之相比計算積分光密度值的百分比作為蛋白質表達的相對水平。

2.7免疫組化SABC法定位eNOS、nNOS、MR蛋白的表達主動脈常規石蠟病理切片完成脫蠟、水化后，用3% H2O2封閉，0.01 mol/L Tris-EDTA抗原修復，正常山羊血清工作液封閉，兔抗鼠I抗4℃孵育過夜(eNOS及nNOS稀釋比例為1∶100，MR為1∶50，陰性對照用PBS代替I抗，同時用大鼠腦組織病理切片設立nNOS陽性對照)。37℃復溫后羊抗兔II抗孵育，DAB鏡下顯色，蘇木素復染，脫水，透明，固定，中性樹膠封片。在400倍普通光鏡下，每例標本隨機選取5個視野進行觀察，以細胞漿內出現棕黃色顆粒判定為陽性表達。

3統計學處理

采用SPSS 11.5統計軟件進行分析。數據采用均數±標準差(mean±SD)表示，組內、組間比較采用單因素方差分析，各組不同時點收縮壓值比較采用重復測量資料的方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1各組收縮壓的變化情況

隨著年齡的增長，C組大鼠收縮壓逐漸升高，實驗8周時升高至(95.25±1.55) mmHg，此后收縮壓保持相對恒定。高鹽飼養8周后大鼠收縮壓開始升高(P＜0.05)，并呈逐漸上升趨勢，16周時與同時點C組相比，HS組大鼠收縮壓明顯升高(P＜0.05)。依普利酮灌胃4周后，Epl組大鼠收縮壓與灌胃前相比明顯下降(P＜0.05)，且低于同時點HS組(P＜0.05)，見表1。

表1　各組收縮壓變化Table 1.The changes of systolic blood pressure in the rats with different treatments (mmHg.Mean±SD.n=21)

2各組主動脈醛固酮含量

ELISA法檢測結果發現，與C組相比，HS組及Epl組主動脈醛固酮含量明顯增高(P＜0.05)，見圖1。

3各組主動脈MR水平

蛋白免疫印跡法檢測結果發現，與C組相比，HS組及Epl組MR水平明顯升高(P＜0.05)，見圖2。

4各組主動脈MR表達的定位

與C組比較，HS組主動脈內皮細胞內棕黃色顆粒明顯增多，平滑肌細胞亦可見棕黃色顆粒增加，提示MR表達明顯增加。給予依普利酮治療后，內皮細胞及平滑肌細胞MR陽性表達仍明顯高于C組，見圖3。

Figure 2.The expression level of MR in the aorta of the rats with different treatments.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs C group.圖2各組主動脈MR水平

5各組主動脈eNOS蛋白表達水平

與C組相比，HS組eNOS蛋白表達水平明顯下降(P＜0.05) ;與HS組相比，Epl組eNOS蛋白水平明顯增高(P＜0.05)，且高于C組(P＜0.05)，見圖4。

Figure 3.The protein expression of MR in the aorta of the rats with different treatments (×400).圖3各組主動脈MR蛋白表達定位

Figure 4.The protein expression of eNOS in the aorta of the rats with different treatments.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs C group;#P＜0.05 vs HS group.圖4各組主動脈eNOS蛋白表達水平

6各組主動脈eNOS和nNOS表達的定位

與C組比較，HS組內皮細胞內棕黃色顆粒減少，提示eNOS表達減少;與HS組比較，Epl組內皮細胞內棕黃色顆粒增多，eNOS表達明顯增加，見圖5。

圖6顯示，nNOS表達陽性對照樣本正常大鼠腦組織神經細胞胞漿內存在大量棕黃色顆粒，而在C組、HS組及Epl組的主動脈內皮細胞和平滑肌細胞的胞漿內可見很少量棕黃色顆粒，表明nNOS在大鼠主動脈呈低水平表達。用圖像分析系統計算平均灰度值進行蛋白半定量分析，結果顯示3組間nNOS表達水平差異不顯著。

7各組主動脈的cNOS活性

與C組相比，HS組主動脈cNOS活性明顯降低(P＜0.05) ;與HS組相比，Epl組cNOS活性明顯增高(P＜0.05)，見圖7。

Figure 5.The protein expression of eNOS in the aorta of the rats with different treatments (×400).圖5各組主動脈eNOS蛋白表達定位

Figure 6.The protein expression of nNOS in the aorta of the rats with different treatments (×400).圖6各組主動脈nNOS蛋白表達定位

討論

鹽敏感性高血壓的發病機制復雜，其中包括內皮功能障礙和RAAS系統激活等機制［2］。高鹽飼養Wistar大鼠心臟組織中MR水平明顯增高［8］。本實驗研究發現，5%高鹽飼料飼養Wistar大鼠8周后血壓即升高，并呈逐漸上升趨勢，16周時大鼠血壓升高更為顯著，同時主動脈醛固酮含量及MR水平也顯著增高，結果與文獻報道是一致的，其機制有待進一步研究。

Figure 7.The activity of cNOS in the aorta of the rats with different treatments.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs C group;#P＜0.05 vs HS group.圖7各組主動脈cNOS活性

主動脈醛固酮含量及MR表達水平增高，是否會影響血管內皮細胞的功能呢?血管內皮細胞對維持血管正常的舒縮功能和調節血壓起著重要的作用，已公認eNOS活性變化是血管內皮功能變化的一個敏感指標。已有文獻表明，用4% NaCl喂養10周的Dahl鹽敏感性高血壓大鼠，主動脈eNOS的活性明顯降低［9］;感覺神經損傷性鹽敏感性高血壓大鼠主動脈eNOS mRNA和蛋白表達均明顯降低［10］。MR拮抗劑可競爭性拮抗醛固酮與MR的結合，增加一氧化氮的生物利用度，改善高血壓、動脈粥樣硬化和心衰過程中的內皮功能紊亂［5，11］。離體水平的研究也發現，用醛固酮處理人臍靜脈內皮細胞24 h后，eNOS蛋白表達降低，給予非選擇性MR拮抗劑螺內酯預處理，可使eNOS蛋白表達增加［12］。目前臨床上使用的MR拮抗劑有非選擇性的螺內酯和選擇性較強的依普利酮2種。依普利酮對醛固酮引起的內皮功能紊亂、氧化損傷和鹽敏感性高血壓等，均能起到較好的保護作用［5］。

本實驗從大鼠整體水平，選用MR選擇性拮抗劑依普利酮對高鹽誘導的高血壓進行治療，結果顯示，高鹽飼養大鼠可使主動脈eNOS蛋白表達減少、cNOS活性降低，依普利酮治療后可恢復eNOS蛋白表達水平，同時使cNOS活性恢復。因cNOS包括eNOS和nNOS2種亞型，故cNOS活性應為2者活性之和。為排除nNOS活性變化對cNOS活性的影響，本實驗用免疫組化染色法觀察了主動脈nNOS陽性表達變化。由3組間cNOS活性變化及nNOS表達差異不顯著的結果可知，HS組主動脈eNOS活性較C組降低，依普利酮治療后eNOS活性有所增加。因此，本實驗結果提示，大鼠攝入高鹽后主動脈醛固酮含量增加，eNOS蛋白表達及活性下降，eNOS的變化可能是由于主動脈內含量增加的醛固酮激動MR后所致。選擇性MR拮抗劑依普利酮，雖未降低醛固酮含量及MR表達水平，但拮抗了醛固酮與MR的結合，阻斷了醛固酮對eNOS的影響，使eNOS蛋白表達及活性升高，改善血管內皮功能，發揮了保護作用。關于醛固酮激動MR后導致eNOS表達降低、使酶活性降低的機制，以及依普利酮增加eNOS表達水平，從而增加酶活性的分子機制，有待下一步深入研究。

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(責任編輯:林白霜，余小慧)

Effects of eplerenone on expression and activity of aortic endothelial nitric oxide synthase in hypertensive rats induced by high-salt intake

ZHANG Qian，DING Jing，YANG Fei，WANG Sheng-nan，SU Feng，LU De-qin
(Department of Pathophysiology，Guizhou Medical University，Guiyang 550025，China.E-mail: dqlu91@hotmail.com)

［ABSTRACT］AIM: To explore the effects of eplerenone on the expression and activity of aortic endothelial nitric oxide synthase (eNOS) in high salt-induced hypertensive rats.METHODS: Male Wistar rats (4 week old，weighting 50～60 g) were randomly divided into control group，high-salt diet group and eplerenone group.The rats in control group were fed with ordinary rodent animal diet，the rats in high-salt group and eplerenone group were exposed to 5% salt diet for 16 weeks and administrated with the same dosage of saline or eplerenone (40 mg· kg(－1)·d(－1)) by gavage for 4 weeks，respectively.Systolic blood pressure (SBP) was measured by tail-cuff every 2 weeks.The rats were sacrificed after 16 weeks and the thoracic aorta was collected.The aldosterone content in the aorta was measured by ELISA.The protein levels of mineralocorticoid receptor (MR) and eNOS were determined by Western blot.The activitie of constitutive NOS (cNOS) was measured by chemocolorimetry.The protein localization of eNOS，neuronal nitric oxide synthase (nNOS) and MR was observed by immunohistochemistry.RESULTS: A process of 8-week high-salt diet increased SBP gradually.SBP in the rats exposure to high salt for 16 weeks was significantly higher than that in control group (P＜0.05).After 4 weeks of eplerenone treatment，SBP in the rats was significantly lower than that before treatment (P＜0.05).Compared with control group，the aldosterone content in the aorta were significantly increased in high-salt diet group and eplerenone group (P＜0.05)，the expression level of MR also increased significantly (P＜0.05).Compared with control group，both eNOS protein expression (P＜0.05) and cNOS activity in high-salt diet group were significantly decreased (P＜0.05).The proteinbook=1607,ebook=79expression of eNOS as well as cNOS activity in aorta increased significantly in eplerenone group compared with high-salt diet group (P＜0.05).CONCLUSION: Aldosterone content in aorta of high-salt-induced hypertensive rats increases significantly.Aldosterone attenuates the protein expression of eNOS and reduces the enzyme activity through the activation of mineralocorticoid receptor.The selective mineralocorticoid receptor antagonist eplerenone enhances the protein expression of eNOS and its activity，thereby improves eNOS function.

［KEY WORDS］Hypertension; High-salt diet; Endothelial nitric oxide synthase; Mineralocorticoid receptor

通訊作者△Tel: 0851-88416116; E-mail: dqlu91@hotmail.com

*［基金項目］國家自然科學基金資助項目(No.30871003) ;貴州省國際科技合作計劃項目［黔科合外G字(2010) 7019號］

［收稿日期］2015-03-23

［文章編號］1000-4718(2015)09-1606-05

［中圖分類號］R363

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.09.013