重組人血管內皮抑制素聯合順鉑對人骨肉瘤MG-63細胞VEGF 基因表達、增殖及侵襲力的影響

張黎明

骨肉瘤是好發于兒童和青少年的常見惡性骨腫瘤，手術及新輔助化療是其主要治療手段，但腫瘤早期肺轉移及部分患者對化療耐藥是造成綜合治療效果不佳、患者死亡率高的主要原因［1］。研究發現，血管內皮生長因子(VEGF)在骨肉瘤等多種惡性腫瘤組織高表達，是目前發現的誘導腫瘤血管生成、促進腫瘤細胞增殖和轉移的關鍵基因［2］。因此，針對阻斷腫瘤血管形成的基因靶向治療對于控制腫瘤局部浸潤及遠處轉移、提高患者生存率具有重要治療價值。重組人血管內皮抑制素(rhEndo)是已知具有抗腫瘤作用的血管生成抑制因子［3］，本研究以骨肉瘤MG-63 細胞為研究對象，旨在觀察rhEndo 對VEGF 蛋白表達、細胞增殖、凋亡及遷移的影響，為進一步探討rhEndo 治療骨肉瘤的作用機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 人骨肉瘤MG-63 細胞購自中科院上海細胞研究所;兔抗人VEGF 單克隆抗體、鼠抗人βactin 單克隆抗體購自美國Santa Cruz 公司;牛血清白蛋白(BSA)、DMEM 培養基、胎牛血清、胰蛋白酶購自GIBCO 公司;CCK-8 試劑盒購自武漢博士德公司。RT-PCR 試劑盒購自美國Promega 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養:在37℃、5% CO2培養箱中，用含10%胎牛血清的DMEM 培養基常規培養人骨肉瘤MG-63 細胞，每2 ～3 天更換1 次培養基，當細胞生長至合適匯合時用0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA 消化分散細胞，進行傳代培養，待細胞處于對數生長期時用于實驗。

1.2.2 RT-PCR:Trizol 提取細胞總RNA，紫外分光光度計測定RNA 純度和濃度。取1 μg 總RNA 用RTPCR 試劑盒反轉錄成cDNA，以此為模板進行后續PCR 擴增。PCR 引物由上海生工生物工程技術有限公司合成，引物序列見表1。擴增完畢后取5 μl PCR產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析儀對條帶進行掃描分析，以VEGF 與β-actin 灰度值的比值來反映VEGF mRNA 表達水平。

表1 VEGF、β-actin 引物序列

1.2.3 Western blot:提取細胞總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，定量上樣進行10% SDS-PAGE 凝膠電泳，電轉移至PVDF 膜上，室溫下用5%脫脂奶粉封閉1 h 或4℃過夜，TBST 洗膜3 次，分別加入稀釋后的兔抗人VEGF IgG 和鼠抗人β-actin IgG，室溫孵育2 h 或4℃過夜，TBST 洗膜3 次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1 h，TBST 洗膜3 次，ECL 顯色定影。使用凝膠分析軟件對條帶進行掃描成像，以VEGF 和βactin 條帶灰度值的比值代表VEGF 蛋白相對表達量。

1.2.4 CCK-8 實驗:MG-63 細胞接種到96 孔板，調整細胞密度為1 ×104/孔，培養箱中孵育24、48、72 h，將100 μl CCK 加入檢測孔內繼續培養2 h，用酶標儀于490 nm 波長處測定吸光度值，細胞相對增殖率% =實驗組OD 值/對照組OD 值×100%。

1.2.5 流式細胞術:使用流式細胞儀檢測Annexin-V+ /PI-比值代表細胞凋亡率。PBS 洗細胞2 次，重懸后調整細胞濃度為1 ×106個/ml，取100 μl 細胞懸液置于流式管中，加入5 μl annexin V-FITC 和10 μl PI溶液，震蕩混勻，室溫避光孵育15 min;于管中加入300 μl 結合緩沖液，1 h 內上機檢測，記錄激發波長488 nm 處紅色熒光，以百分數表示凋亡率。細胞凋亡率=凋亡細胞數/總細胞數×100%。

1.2.6 Transwell 小室體外遷移實驗:細胞生長至對數生長期后消化細胞，分別用PBS、無血清培養基洗滌1次，重懸后調整細胞濃度為2 ×105個/ml，將100 μl 細胞懸液及含10% FBS 的500 μl DMEM 培養基分別接種于上室和下室。37℃培養20 h 后取出小室，棄去上室內液體，用棉簽擦拭上室面未遷移的細胞，下室面用結晶紫染色。顯微鏡下隨機計數基底膜下室10 個視野的穿膜細胞數，求取均數即為穿膜細胞數，重復6 次。

1.3 統計學分析 應用SPSS 10.0 統計軟件，計數資料采用χ2檢驗，計量資料以± s 表示，采用t 檢驗，P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 rhEndo 對細胞VEGF mRNA 和蛋白表達的影響首先我們采用RT-PCR 和Western blot 技術檢測1、10、20 μg/ml rhEndo 對細胞VEGF mRNA 和蛋白表達的影響。結果顯示，隨著rhEndo 濃度增加，VEGF mRNA 和蛋白表達量均逐漸降低，差異有統計學意義(P ＜0.05)，提 示rhEndo 可呈劑量依賴性的抑制VEGF 表達。其中20 μg/ml rhEndo 對VEGF 表達的抑制作用最強，因此，以下實驗我們選用的rhEndo 濃度為20 μg/ml。順鉑組、rhEndo、rhEndo 聯合順鉑組VEGF 蛋白表達量均較對照組顯著降低，差異有統計學意義(P ＜0.05);與順鉑、rhEndo 單藥組比較，聯合用藥組對VEGF 表達的抑制作用更加顯著，差異有統計學意義(P ＜0.05)，順鉑與rhEndo 單藥組比較差異無統計學意義(P ＞0.05)。見表2、3。

表2 rhEndo 對細胞VEGF mRNA 和蛋白表達的影響 ± s

表2 rhEndo 對細胞VEGF mRNA 和蛋白表達的影響 ± s

注:與對照組比較，* P ＜0.05;與1 μg/ml rhEndo 組比較，#P ＜0.05;與10 μg/ml rhEndo 組比較，△P ＜0.05

組別 VEGF mRNA 相對表達水平 VEGF 蛋白相對表達水平對照組3.21 ±0.28 2.34 ±0.16 1 μg/ml rhEndo 組 2.56 ±0.18* 1.12 ±0.08*10 μg/ml rhEndo 組 1.79 ±0.15＊△ 0.61 ±0.05* #20 μg/ml rhEndo 組 0.96 ±0.08＊△ 0.28 ±0.03＊△

表3 4 組VEGF mRNA 和蛋白表達比較 ± s

表3 4 組VEGF mRNA 和蛋白表達比較 ± s

注:與對照組比較，* P ＜0.05;與順鉑組和rhEndo 組比較，#P ＜0.05

組別 VEGF mRNA 相對表達水平 VEGF 蛋白相對表達水平對照組3.21 ±0.28 2.34 ±0.16順鉑組 1.04 ±0.11* 0.32 ±0.06*rhEndo 組 0.96 ±0.08* 0.28 ±0.03*rhEndo 聯合順鉑組 0.41 ±0.05* # 0.13 ±0.02*#

2.2 細胞增殖、凋亡情況比較 我們采用CCK-8 實驗和流式細胞術分別檢測不同時間點各組細胞增殖和凋亡情況。結果顯示，順鉑組、rhEndo 組、rhEndo 聯合順鉑組細胞相對增殖率均較對照組顯著降低，凋亡率均較對照組顯著增加，差異有統計學意義(P ＜0.05);與順鉑、rhEndo 單藥組比較，聯合用藥組細胞相對增殖率和凋亡率變化更加顯著，差異有統計學意義(P ＜0.05)，順鉑與rhEndo 單藥組比較差異無統計學意義(P ＞0.05)。見表4、圖1。

表4 4 組細胞增殖、凋亡情況比較 ± s

表4 4 組細胞增殖、凋亡情況比較 ± s

注:與對照組比較，* P ＜0.05;與順鉑組和rhEndo 組比較，#P ＜0.05

組別 相對增殖率(%)24 h 48 h 72 h 凋亡率(%)1.22±0.03 1.39±0.02 1.51±0.05 0.57±0.01順鉑組 1.15±0.03* 1.31±0.03* 1.37±0.05* 6.74±0.47*rhEndo 組 1.14±0.02* 1.30±0.02* 1.35±0.04* 7.02±0.49*rhEndo 聯合順鉑組 1.08±0.01* # 1.18±0.03* # 1.20±0.02* # 13.21±1.02*#對照組

圖1 CCK-8 檢測各組24 h、48 h 及72 h 增殖情況

2.3 細胞侵襲遷移情況比較 Transwell 小室體外遷移實驗檢測細胞侵襲遷移能力。結果顯示，順鉑組、rhEndo 組、rhEndo 聯合順鉑組侵襲細胞數均較對照組顯著降低，差異有統計學意義(P ＜0.05);與順鉑、rhEndo 單藥組比較，聯合用藥組侵襲細胞數降低更加顯著，差異有統計學意義(P ＜0.05)，順鉑與rhEndo單藥組比較差異無統計學意義(P ＞0.05)。見表5。

表5 4 組細胞侵襲遷移情況比較 ± s

表5 4 組細胞侵襲遷移情況比較 ± s

注:與對照組比較，* P ＜0.05;與rhEndo 組比較，#P ＜0.05

組別 侵襲細胞數對照組65.48 ±5.22順鉑組 43.11 ±3.25*rhEndo 組 40.76 ±3.17*rhEndo 聯合順鉑組 19.53 ±2.04*#

3 討論

骨肉瘤是一種惡性程度極高的原發性骨腫瘤，其發病率居兒童、青少年惡性骨腫瘤的首位［4］。經截肢進行廣泛切除手術后患者的10 年生存率僅為15%，即使采取聯合新輔助化療和截肢治療仍不能進一步提高患者生存率，這主要是因為約40%的患者已經發生肺轉移，這是該病死亡率和復發率高、預后差的主要原因［5，6］。近年來，有關骨肉瘤轉移機制及抗轉移療法的研究和探索成為腫瘤研究領域的熱點，這對于防治骨肉瘤進而提高患者生存率至關重要。然而，目前尚無效果理想的抗轉移療法。因此，尋找有效的治療靶點及措施是減少肺轉移發生及治療骨肉瘤的關鍵。

研究顯示，惡性腫瘤的生長、浸潤與轉移與新生血管的生成密切相關，不僅為癌細胞生長提供豐富的營養，還為癌細胞擴散和轉移提供了血管通路［7］。臨床試驗表明，骨肉瘤患者術后促血管生成因子與血管生成抑制因子表達失衡，與早期肺轉移發生密切相關［8］。基礎實驗也證實裸鼠圍手術期抑制新生血管的生成能夠明顯減少腫瘤肺轉移的發生［9］。VEGF 是腫瘤血管形成中的關鍵因子，是目前已知作用最強的促血管生成因子。研究顯示VEGF 在胃癌、膀胱癌等多種惡性腫瘤組織異常高表達，參與腫瘤細胞的抗凋亡及侵襲轉移過程［10］。VEGF 通過自分泌或旁分泌的方式發揮刺激血管內皮細胞增殖分化、促進腫瘤血管形成、抑制腫瘤細胞凋亡的作用，同時還使血管通透性增加，為癌細胞的浸潤和轉移提供血管支持物。Rastogi 等［11，12］采用ELISA 法和免疫組化法檢測骨肉瘤患者血清和腫瘤組織VEGF 表達狀況，結果顯示，與健康正常人比較骨肉瘤患者VEGF 表達水平顯著增高，化療后患者VEGF 表達水平明顯降低，且發生肺轉移者VEGF 表達水平明顯高于未發生肺轉移者，提示VEGF 表達水平不僅對于骨肉瘤診斷具有參考價值，而且可以作為判斷腫瘤復發、轉移及預后不良的分子標志物。由此可見，靶向VEGF 和血管生成的治療措施具有廣泛的應用前景和治療意義。

rhEndo 作為一種新型、強效血管生成抑制劑，已于2005 年上市并廣泛應用于骨肉瘤、小細胞肺癌等多種惡性腫瘤的臨床治療。臨床研究證實，rhEndo 與化療藥物聯用能夠增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，發揮協同抗腫瘤作用，改善患者預后［13］。其作用機制是通過特異性阻斷VEGF/VEGFR 信號途徑從而抑制血管內皮細胞的分裂、增殖和遷移以及血管、淋巴管生成，最終產生抑制腫瘤生長和侵襲轉移的作用。

本研究中我們采用RT-PCR 和Western blot 檢測rhEndo 聯合順鉑對骨肉瘤MG-63 細胞VEGF mRNA和蛋白表達的影響以及細胞體外增殖能力、凋亡情況及遷移能力的變化，由此推斷VEGF 在骨肉瘤增殖、侵襲及轉移過程中的作用，并進一步探討rhEndo 治療骨肉瘤的可能作用機制。RT-PCR 和Western blot 結果顯示，與對照組比較，順鉑組、rhEndo 組以及rhEndo 聯合順鉑組MG-63 細胞VEGF mRNA 和蛋白水平均有不同程度降低;與單藥相比，聯合用藥能夠顯著抑制VEGF mRNA 和蛋白表達，較單藥組差異有統計學意義(P ＜0.05)，提示rhEndo 除了作用于腫瘤組織中的血管內皮細胞外，也能直接下調腫瘤細胞VEGF 的表達抑制血管生成。CCK-8 結果顯示，rhEndo 組、順鉑組及rhEndo 聯合順鉑組細胞增殖率均較對照組降低，細胞凋亡率均較對照組升高，表明腫瘤細胞的增殖力明顯減弱;而聯合用藥組細胞增殖率最低，凋亡率最高，較單藥組差異有統計學意義(P ＜0.05)，提示聯合用藥組抑制骨肉瘤細胞的增殖具有協同作用。Transwell 小室實驗結果也顯示，rhEndo 組、順鉑組及rhEndo 聯合順鉑組穿膜細胞數量均較對照組減少，表明腫瘤細胞的侵襲力明顯減弱;而聯合用藥組穿膜細胞數最少，較單藥組差異有統計學意義(P ＜0.05)，提示聯合用藥組抑制骨肉瘤細胞的侵襲力具有協同作用。由此可見，rhEndo 聯合順鉑用藥時，能進一步增強順鉑抑制腫瘤細胞增殖和侵襲﹑誘導細胞凋亡的作用，具有更為顯著的抗腫瘤效應。

總之，鑒于VEGF 在骨肉瘤發病機制中的作用，針對VEGF 的分子靶向治療必將成為抗腫瘤新的研究方向和熱點。本研究結果表明，抗腫瘤血管生成治療對于骨肉瘤具有顯著療效，重組人血管內皮抑制素聯合順鉑方案可能成為骨肉瘤治療的新策略，尤其對于出現轉移和對化療耐藥的患者，重組人血管內皮抑制素有可能具有更大的治療價值。

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