宿主免疫系統IL-2、TNF-α 基因啟動子多態性與丙型肝炎病毒慢性感染的相關性研究*

許秀雯，李 瑩，童紹勇，姚宇峰，俞建昆，史 荔，孫明波

(中國醫學科學院 北京協和醫學院醫學生物學研究所 云南省重大傳染病疫苗研發重點實驗室，云南 昆明 650118)

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(hepatitis C Virus，HCV)感染引起的疾病。HCV 感染后，20%～30%的急性感染者可自發清除HCV，其余感染者都將發展為慢性持續性感染，并最終發展為肝硬化(15%～20%)和肝細胞癌(1%～4%)［1］。研究表明，在HCV 感染后的炎性反應及在抗感染的宿主機體免疫應答過程中，腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)、白細胞介素(interleukin，IL)-2、IL-10、IL-12 等細胞因子可通過介導不同的免疫反應，導致病毒清除、持續感染或肝臟損傷等不同結果［2－6］。炎性因子及調控細胞因子平衡的個體差異在某種程度上取決于細胞因子基因調控區的等位基因多態性，這些多態性可影響細胞因子的表達，從而在HCV 清除及持續感染中發揮重要作用［7－8］。TNF-α 是由主要組織相容性抗原(MHC)Ⅲ類基因編碼的多功能免疫調控因子，它能募集和激活巨噬細胞、NK 細胞和T 細胞，從而產生免疫調節及抗病毒細胞因子，促進肝細胞炎性反應、介導肝細胞損傷及慢性肝炎。研究表明，TNF-α 基因啟動子單核苷酸多態性位點(single nucleotide polymorphism sites，SNPs)-238 和-308 與TNF-α 的表達水平相關［9－10］。IL-2 是主要由活化的CD4+T 細胞和CD8+T 細胞產生的具有廣泛生物活性的細胞因子，是所有T 細胞亞群的生長因子，并可促進活化B 細胞增殖，為調控免疫應答的重要因子。研究表明，IL-2 的表達水平在中度及重度肝硬化及肝癌中高于正常對照，與丙肝的分級相關，且IL-2 啟動子基因-330 SNP 與HCV 的持續存在相關［11－13］。本研究選擇IL-2 基因啟動子SNP rs2069762、rs2069763 和rs4833248，以及TNF-α 基因啟動子SNPrs1800629、rs3093668 和rs3093726，探討其基因及單倍型與慢性HCV 感染的遺傳易感性的關聯。

1 材料與方法

1.1 標本來源

選擇380 名HCV 慢性感染者作為病例組，按照中華醫學會肝病學分會和傳染病與寄生蟲病學分會2011 年制定的《丙型病毒性肝炎防治指南》確定HCV 感染，實驗學檢查指標ALT、AST、抗HCV、HCV RNA 等檢測陽性，并排除其他肝炎的患者。選擇健康個體367 名為對照組。健康對照的納入標準為HCV 診斷及實驗學檢查指標ALT、AST、抗HCV、HCVRNA 等正常。病例組年齡(44.22±12.40)歲，對照組(44.75±9.21)歲;病例組男性207(54.47%)例，女性173 例(45.53%);對照組 男 性 187 例(50.95%)，女 性 180 例(49.05%)。兩組間性別比例和年齡分布差異無統計學意義(P ＞0.05)。所有參加者均是為居住于云南地區的彼此無血緣關系漢族個體。患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 采集空腹靜脈血5 mL，用EDTA 或肝素抗凝，使用AxyPrep 血基因組DNA 小量試劑盒提取DNA。

1.2.2 IL-2 及TNF-α 基因SNP 位點基因分型采用實時熒光定量PCR 法進行SNP 分型。由Applied Biosystems 公司定制合成IL-2 基因啟動子SNP rs2069762(－330，A ＞C)、rs2069763(－34，G ＞T)和rs4833248(－2811，G ＞A)，TNF-α 基因啟動子SNPrs1800629(－308，G ＞A)、rs3093668(G ＞C)和rs3093726(T ＞C)位點的引物及Taq-Man 探針。針對每個SNP 位點所設計的兩條探針分別用VIC 和FAM 進行熒光標記。羅氏LightCycler480 實時熒光定量PCR 儀檢測SNP 位點，LCS480 1.5.1.62 軟件進行基因分型。PCR 反應體積為20 μL，反應條件:95 ℃10 min 預變性，92 ℃15 s 變性，60 ℃1 min 退火，共40 個循環，40 ℃5 min 延伸。以3 個已知基因型(野生純合子、突變純合子、雜合子)的標準樣品作為對照，采用測序的方法對TaqMan 分型結果進行驗證。針對各個SNP 位點，應用DNASTAR 軟件設計6 對引物，引物合成及PCR 產物測序在上海生工生物技術有限公司完成。

1.3 統計學分析

Hardy-Weinberg 平衡檢驗基因型頻率的代表性，以各基因型的個體數計算各基因型和等位基因頻率，經χ2檢驗檢測健康對照組與HCV 慢性感染組6 個SNP 基因型、等位基因頻率差異，P ＜0.05認為差異有顯著性。SHEsis 軟件程序計算連鎖不平衡，常用D'表示;D'值為零時，連鎖完全平衡;D'值為1 時，連鎖完全不平衡;D'＞0.8 時，即存在強連鎖。根據LD 結果構建IL-2 基因和TNF-α 基因啟動子區域的各3 個SNP 位點的單倍型［14－15］。

2 結果

2.1 IL-2 和TNF-α 多態性位點的等位基因頻率與基因型頻率

IL-2 基因啟動子SNP rs2069762、rs2069763 和rs4833248，以及TNF-α 基因啟動子SNPrs1800629、rs3093668 和rs3093726 基因型分布在病例組和對照組中均符合Hardy-Weinberg 平衡(P ＞0.05)。IL-2-rs2069762(A ＞C)CC 頻率，病例組高于對照組，差異有統計學意義(P ＜0.05);IL-2-rs2069763(G ＞T)等位基因G 頻率，病例組中高于對照組，差異有統計學意義(P ＜0.05);其余SNPs 等位基因和基因型頻率在病例和對照組中的分布，差異無統計學意義(P ＞0.05)。見表1。

表1 兩組被檢者IL-2 和TNF-α 基因啟動子6 個SNP 位點的基因頻率及等位基因頻率Tab.1 Gene frequencies and allele frequencies of 6 SNPs in IL-2 and TNF-α gene promoter of objects in the two groups

2.2 IL-2 及TNF-α 多態性位點的連鎖不平衡檢測結果

IL-2 基因啟動子區域3 個多態性位點的連鎖不平衡分析顯示:rs2069762 與rs2069763 之間的D'值為1.000，rs2069762 和rs4833248 位點間的D'值為0.994，rs2069763 和rs4833248 位點間的D'值為0.958，三位點之間存在強連鎖不平衡。TNF-α基因啟動子區域3 個多態性位點的連鎖不平衡分析顯示:rs1800629 與rs3093668 之間的D'值為0.963，rs1800629 和 rs3093726 位 點 間 以 及rs3093668 和rs3093726 位點間的D'值均為1.000，三位點之間存在強連鎖不平衡。

2.3 IL-2 及TNF-α 多態性位點單倍型構建及頻率

rs2069762/rs2069763/rs4833248-ATG 單倍型頻率在病例和對照組中的分布差異具有統計學意義(P ＜0.05)，見表2。TNF-α 基因啟動子區域的3 個SNP 位點的單倍型頻率在病例和對照組中的分布差異無統計學意義(P ＞0.05)，見表3。

表2 兩組被檢者IL-2 基因啟動子SNP 位點的單倍型頻率Tab.2 Haplotype frequencies in IL-2 gene promoter of objects in the two groups

表3 兩組被檢者TNF-α 基因啟動子SNP 位點的單倍型頻率Tab.3 Haplotype frequencies in TNF-α gene promoter of objects in the two groups

3 討論

免疫細胞在抗HCV 感染過程中分泌大量的細胞因子介導不同的免疫反應，從而導致病毒清除、持續感染或肝細胞損傷等不同結果。細胞因子基因，特別是啟動子基因多態性影響著細胞因子的表達水平，從而與HCV 慢性感染進程相關。

本研究結果表明，IL-2 基因啟動子rs2069762(－330，A ＞C)CC 基因型在病例組中高于對照組(P ＜0.05)，等位基因型C 在病例組中的頻率也高于對照組(P ＞0.05)，提示rs2069762CC 基因型可能是HCV 慢性感染的易感因素。Gao 等［11］研究結果表明，IL-2－330 SNP 與HBV、HCV 以及HBV/HCV 共感染后病毒的持續存在相關。本研究結果顯示，與rs2069762 緊密連鎖的rs2069763(G ＞T)，等位基因G 的頻率在病例組中也高于對照組(P ＜0.05);rs2069762/rs2069763/rs4833248 位點構建的單倍型ATG 在病例組中的頻率低于對照組(P ＜0.05)，提示ATG 單倍型可能降低HCV 慢性感染的風險(OR=0.812，95%CI 0.662 ～0.996)。IL-2能誘導T、B 細胞的增殖與分化，在抗病毒感染的免疫中發揮重要作用［16］。研究發現，IL-2 基因啟動子區域－330SNP 與IL-2 的分泌量相關［17］。本研究結果發現，IL-2 啟動子區域的2 個SNP 均與HCV 的慢性感染相關，提示IL-2 基因啟動子SNP可能是云南漢族人群中HCV 易感的關聯因素。

TNF-α 具有誘導靶細胞凋亡，與IL-2 協同促進T 細胞產生IFN-γ，以及增強巨噬細胞的活性和殺傷功能的特性;也能夠抑制B 細胞增殖和分泌免疫球蛋白。TNF-α 基因啟動子區域含有多個轉錄因子結合位點，可直接影響TNF-α 的轉錄調控。多個研究報道TNF-α 基因多態性與HCV 感染等多種感染性疾病相關，其中，報道較多的為TNF-α啟動子基因-308G/A 和－238G/A［18－19］。然而，不同研究所報道的TNF-α 啟動子基因與HCV 慢性感染的相關性并不一致［20－23］。本研究研究對3 個TNF-α 啟動子基因進行分析，但結果未發現與HCV 慢性感染相關的等位基因、基因型及單倍型，與He 等［22］對TNF-α-308G/A 的meta 分析結果一致。另一方面，人群的遺傳背景影響著基因多態的分布。在高加索人群中多態性較高的TNF-α 啟動子基因SNP 在亞洲人群中的多態性較低，TNF-αrs1800629 A 等位基因頻率為6%，rs-3093668 C 等位基因的頻率僅為3%，rs-3093726 C 等位基因頻率低至1%。因此，在其他人群中報道的與丙肝相關的SNP 與本研究結果并不一致，可能存在其他的SNP，有待于使用全基因組關聯分析去發現新的易感位點。

綜上所述，在云南漢族群體中，IL-2 基因啟動子SNPrs2069762 CC 基因型和rs2069763 G 等位基因可能是HCV 慢性感染的易感因素，rs2069762/rs2069763/rs4833248 單倍型ATG 可能是HCV 慢性感染的保護性因素。TNF-α 基因啟動子SNPrs1800629、rs3093668 和rs3093726 與HCV 慢性感染沒有相關性。

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