桉檸蒎對慢性阻塞性肺疾病大鼠肺功能和氣道細菌負荷的影響*

李文揚，于 娜，孫宜田，康 健

(中國醫科大學附屬第一醫院 呼吸疾病研究所，遼寧 沈陽 110001)

慢性組塞性肺疾病(COPD)是一種慢性進展惡化的炎癥性疾病，多種原因可引起COPD 的急性加重。目前黏液纖毛清除(MCC)功能在COPD 發病中的作用日益引起人們的重視［1］。MCC 功能障礙和氣道炎癥，使細菌容易在下呼吸道定植，細菌負荷達到某一閾值水平，可引起COPD 急性發作，是使病情惡化的主要原因之一［2］。有報導桉檸蒎有促進MCC 功能，增快粘液移動速度，從而稀化黏液的作用［3］。為證實桉檸蒎是否改善COPD 大鼠肺功能并提高細菌清除能力，以及其在細菌清除中所起到的作用，本研究應用煙熏大鼠模擬COPD 模型觀察桉檸蒎對MCC 功能與細菌定植的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

桉檸蒎(九龍公司)，過濾嘴香煙(大前門，上海)，Thermo 超凈工作臺，自制煙熏箱，離心機，小動物肺功能議AniRes1030，流感嗜血桿菌，培養皿。

1.2 模型構建及分組

SPF 級雄性Wister 大鼠120 只，由中國醫科大學實驗動物中心提供，鼠齡12 周，體重(200±20)g，隨機分為對照組、模型組、預防組和治療組，每組30 只。分籠飼養于中國醫科大學呼吸實驗室，室溫18 ～20 ℃，濕度50%的潔凈環境，12 h 交替采光，普通飼料喂養，自由飲水進食。模型組、預防組及治療組給予煙熏飼養12 周，一次熏煙燃燒大前門牌香煙40 支，每支香煙約產生煙霧2 L，煙霧濃度8%～10%，持續0.5 h，每日吸煙2 次，上下午各一次，每周5 d，連續12 周。預防組從實驗之日起，上午吸煙前30 min 給予桉檸蒎300 mg/kg 灌胃，不吸煙日不給藥;治療組從實驗第9 周起給予桉檸蒎，給藥方法同預防組。對照組和模型組與預防組同時間給純凈水1.5 mL 灌胃，不吸煙日不給藥。

1.3 方法

1.3.1 病理標本的制作 取右肺中葉，用10%甲醛溶液固定，常規脫水，石蠟包埋，切片，HE 染色。進行病理形態學觀察。

1.3.2 肺功能測定 造模12 周后，各組隨即取6只大鼠，腹腔注射麻醉，仰臥位固定于操作臺上，縱行切開頸部皮膚約2 cm，鈍性分離皮下組織暴露氣管，在環狀軟骨下兩個氣管環處切一倒“T”型切口，行氣管插管并固定。然后在大鼠左側胸部作一切口，將與小動物肺功能儀壓力傳感器相連的胸腔管通過肋間隙插入胸膜腔，采用Medlab 醫學軟件分析系統測定潮氣量、氣道流速、跨肺壓，換算成氣道阻力和肺順應性。測定呼氣峰流速(PEF)、用力呼氣容積50%肺活量的瞬間流量(FEF50%)、第0.3秒呼氣容積(FEV0.3)、第0.3 秒用力呼氣容積與用力肺活量百分比(FEV0.3/FVC)、功能殘氣量(FRC)等指標，證實通氣功能下降并以阻塞性氣流受限為主。

1.3.3 細菌負荷的測定 在第12 周結束后麻醉大鼠，通過注射器針頭滴入氣管內1.5×107cfu/0.1 mL 的流感嗜血桿菌(Hi)混懸液，分別于接種3、6、12 及24 h 后分批處死大鼠，每批處死6 只，行左肺肺泡灌洗。10%水合氯醛3 mL/kg 腹腔注射麻醉大鼠，股動脈放血處死動物。無菌操作下頸部正中切開皮膚，剪開肌肉后暴露氣管，眼科剪尖端向心與頸部平面呈30°角剪一小口，直徑1.5 mm 朔料軟管行氣管插管進入2 cm，雙重棉線結扎固定。沿胸骨打開胸腔，暴露心臟，夾閉右主支氣管，注射器吸取生理鹽水與氣管插管相連，用4 ℃冷藏的生理鹽水灌洗左肺2 次，30 ～60 s 內緩注4 mL，在肺內停留30 s，每次反復推抽兩次，收集灌洗液，回收率達90%，雙層紗布過濾去除粘液等物，留取支氣管肺泡灌洗液(BALF)。4 ℃1 000 r/min 離心10 min。完整取出全肺制成肺組織勻漿。將BALF沉渣和倍比稀釋后的肺組織勻漿分別接種于巧克力培養基上，5%CO2、37 ℃孵育箱中培養24 h［4－5］，計數BALF 和肺組織勻漿的細菌菌落。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0 統計軟件分析。數據均以均數±標準差()表示，兩組間比較用t 檢驗，多組間比較采用方差分析，以P ＜0.05 為差異有統計學意義。變量間相關性用多元線性回歸分析，P ＜0.05有相關性，r 越接近1，相關性越顯著。

2 結果

2.1 形態學改變

光鏡下可見對照組肺泡壁完整，沒有明顯的炎細胞浸潤，而模型組有一定量淋巴細胞等炎癥細胞浸潤并伴有肺泡壁破裂、肺泡融合，肺泡腔增大。預防組和治療組大鼠前述病理改變較模型組均有不同程度的減輕，浸潤的炎細胞減少，肺泡腔擴大減輕。

2.2 肺功能測定

模型組大鼠FEV0.3/FVC ＜70%，且FRC 較對照組明顯增加，兩組比較差異有統計學意義(P ＜0.01)，功能學上達到氣流阻塞的程度。預防組和治療組的FRC 明顯低于模型組，預防組改善更為顯著，與對照組比較差異無統計學意義(P ＞0.05)，PEF、FEF50%、FEV0.3、FEV0.3/FVC 各組間比較差異無統計學意義(P ＞0.05)。見表1。

表1 各組大鼠的肺功能比較(，n=6)Tab.1 Comparison of pulmonary function of rats in each group

表1 各組大鼠的肺功能比較(，n=6)Tab.1 Comparison of pulmonary function of rats in each group

(1)與對照組比較，P ＜0.01;(2)與模型組比較，P ＜0.01;(3)與對照組比較，P ＜0.05;(4)與模型組比較，P ＜0.05

組別 FRC(mL) FEV0.3/FVC(%) FEV0.3(mL/s) PEF(L/s) FEF50%(L/s)對照組 129.6±10.5 76.4±5.1 6.7±0.3 30.3±0.5 25.9±0.6模型組 200.1±42.0(1) 65.6±5.9(1) 6.3±0.7 29.0±1.8 24.0±2.3預防組 144.4±8.3(2) 68.8±6.6(3) 6.5±0.1 30.2±1.7 24.0±0.7治療組 170.5±14.6(1)(4) 68.6±7.2(3)6.6±0.2 29.8±0.4 24.8±1.2

2.3 細菌負荷

模型組的BALF 和肺組織勻漿的菌落計數在各時間點均明顯高于對照組(P ＜0.01)。除對照組BALF 菌落計數呈直線下降及模型組肺勻漿菌落計數于12 h 后再次升高呈波動型外，各組菌落計數均于種菌后第6 h 達到高峰，之后下降。于3、12 及24 h 時，預防組和治療組的肺勻漿菌落計數較模型組明顯降低，且預防組下降更為顯著，特別是24 h 時，預防組明顯低于治療組(P ＜0.01)，基本接近正常組;但在6 h 時，模型組、預防組及治療組3 組肺勻漿細菌菌落計數差異無統計學意義。于3 h、12 h，預防組和治療組的BALF 菌落計數較模型組明顯降低，且預防組下降更為顯著(P ＜0.01);在12 h 時，預防組的BALF 菌落計數明顯低于模型組及治療組(P ＜0.05);在24 h，預防組基本接近正常組。見表2、表3。

2.4 大鼠肺勻漿細菌負荷與肺功能的相關性

各組大鼠種菌后3、12 及24 h 時的肺勻漿菌落計數與FRC 呈顯著正相關(P ＜0.01)，r 分別為0.55、0.715、0.742;6 h 的 肺 勻 漿 菌 落 計 數 與FEV0.3/FVC 呈負相關(P ＜0.05)，r 為－0.367;而FEV0.3與細菌負荷無相關性(P ＞0.05)。見表4。

表2 各組大鼠不同時間點的肺勻漿細菌菌落計數(105cfu，n=6)Tab.2 Bacterial colony count of lung homogenate of rats in each group at different time points

表3 各組大鼠不同時間點的BAIF 細菌菌落計數(105cfu，n=6)Tab.3 Bacterial colony count of BAlF of rats in each group at different time points

表4 肺功能對大鼠肺勻漿細菌計數多元線性回歸分析Tab.4 Multivariate linear regression analysis on pulmonary function and bacterial colony count of lung homogenate of rats

3 討論

細菌感染是引起COPD 急性發作的一個重要原因，MCC 功能在呼吸道防御機制中起著主要作用，它主要通過纖毛擺動，對黏液的清除，從而把吸附在黏液中的細菌等微生物排出體外，減低氣道的細菌負荷。因此，在正常情況下，下呼吸道始終保持無菌狀態。COPD 患者在吸煙或其他有害因素作用下，MCC 功能減低，分泌物便在氣道中積聚，使細菌容易在下呼吸道定植。細菌及其產物通過增強黏液分泌，直接或間接損害纖毛運動，導致MCC 功能進一步下降，并能持續刺激宿主免疫反應，導致進行性氣道破壞，形成惡性循環，加重COPD 進展［2］。隨著黏液活性藥物桉檸蒎在COPD中的臨床應用增加，對其認識愈加深入。按檸蒎主要成分為桉油精、檸檬烯及α－蒎烯，有研究報導這3 種成分均有祛痰、抗菌作用［3，6］;其主要成分桉油精為桃金娘科桉屬植物的主要提取物，因具有促進MCC 功能，增加黏液移動速度，稀化黏液。

吸煙誘導的COPD 大鼠模型病理學上能出現肺氣腫和炎細胞浸潤改變，功能學上肺功能也能達到COPD 的診斷標準。本研究采用Wistar 大鼠被動吸煙12 周，形態學上出現了肺氣腫改變和淋巴細胞等炎細胞浸潤［7－8］，。小動物肺功能儀測定FEV0.3/FVC ＜70%，病理學和功能上符合COPD 大鼠模型標準。肺功能檢測結果顯示桉檸蒎能降低功能殘氣量，且預防給藥組改善更為顯著，可基本接近正常組水平，但其余各項指標均無明顯改善，提示桉檸蒎在一定程度上能夠減少COPD 大鼠肺泡死腔，改善肺泡過度充氣，但短期內應用不能延緩肺功能的下降趨勢或改善肺功能。

COPD 穩定期和急性發作期下呼吸道均可分離出病原菌［9－10］。宿主的炎癥反應與氣道細菌負荷量的增加成正比，當細菌負荷達到某一閾值，便可引起COPD 急性加重［11］，其中流感嗜血桿菌感染占第一位。本研究以流感嗜血桿菌為例，將各組大鼠氣道內接種該菌，在不同時間點計數不同組別大鼠氣道內的細菌負荷并進行統計分析;結果表明，氣道內細菌負荷在同一時間點各組間比較有統計學意義，模型組較對照組明顯升高，桉檸蒎預防組和治療組較模型組明顯降低，其中預防組降低更加顯著;各組菌落計數均于種菌后6 h 達到高峰，之后下降，預防組于24 h 基本接近正常組，且明顯低于治療組;提示桉檸蒎在減低COPD 大鼠下呼吸道細菌負荷有一定的作用，同時表明預防用藥好于治療用藥。MCC 是氣道的非特異免疫功能，在早期即可發揮作用，本研究通過選取不同時間點計數細菌負荷，證明種菌后6 ～12 h，MCC 能發揮最大效應。模型組大鼠肺勻漿的菌落計數于12 ～24 h有所回升，究其原因可能是由于MCC 功能障礙，不能及時清除細菌而在此時間段出現細菌生長與繁殖大于清除。而細菌負荷的加重亦會導致氣道表面Muc5b 生成量的減少，進而引起MCC 功能的進一步損傷［11－13］。

本研究還通過多元線性回歸分析細菌負荷與肺功能的相關性，結果顯示氣道細菌負荷與FRC呈顯著正相關，且越到排菌后期相關性越強，與FEV0.3/FVC 呈弱負相關，進而得出氣道細菌負荷受肺功能的影響，肺功能(尤其是FRC 與FEV0.3/FVC)越差，MCC 功能損傷越大，細菌負荷越重。提示改善肺功能有利于恢復MCC 功能，增強氣道內細菌清除，減少COPD 急性發作。

總之，本研究首次證實了作為黏液促排新藥和黏液纖毛清除系統恢復劑的桉檸蒎可以減少吸煙誘導大鼠的肺功能殘氣量，并減低其氣道流感嗜血桿菌細菌負荷。結果表明桉檸蒎對COPD 有效可能是通過對細菌的清除增加即降低細菌負荷起作用的，提高呼吸道黏液清除效率，全面恢復氣道的宿主防御功能，打破炎癥的惡性循環，有效加速呼吸系統炎性反應的臨床恢復，降低氣道的易感性，減少感染復發，減少呼吸道感染時抗生素治療用藥周期，全面改善COPD 患者的生活質量［14］。目前已有報道證實其亦有一定的抗炎作用，呂小琴等［15］研究發現藍桉油(桃金娘科植物提取物)對脂多糖引起的大鼠慢性支氣管炎具有一定的抗炎作用，并能抑制其氣道黏蛋白高分泌現象。因此，桉檸蒎改善MCC 功能并減少細菌定植的藥理作用及相關分子生物學機制仍需進一步深入研究。隨著COPD 發病機制研究的深入，桉檸蒎的長期應用可能延緩該病的進展，并有可能成為針對病原菌的抗微生物制劑的補充療法［16］。

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