慢病毒載體介導的RNA 干擾對HDAC2 基因表達的影響*

劉燕青，黃 健，黃韻祝＊＊，婁方方，孔維瑩

(1.貴州醫科大學 醫學檢驗學院，貴州 貴陽 550004;2.貴州醫科大學附院 生化科，貴州 貴陽 550004)

組蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)屬于I 類組蛋白去乙?；?，其催化結構含有與鋅離子螯合的保守氨基酸殘基，能調控細胞信號轉導和基因表達［1］。HDAC2 在腫瘤組織中有異常表達，與腫瘤的發生、發展有關，在某些特定的腫瘤中HDAC2的刪除可導致腫瘤細胞生長停滯和凋亡［2－5］。本課題組前期研究利用基因克隆技術構建了3 對針對HDAC2 基因的慢病毒重組表達質粒pLKO.1-HDAC2-shRNA 1、2、3，并經酶切鑒定和測序驗證證實3 對重組質粒構建成功。本研究利用課題組構建的HDAC2 基因重組慢病毒表達質粒pLKO.1-HDAC2-shRNA，制備高濃度的慢病毒顆粒，感染人肝癌細胞株HepG2，觀察HDAC2 基因的mRNA 和蛋白水平表達，從而判斷其干擾效率，為后續研究HDAC2 基因的功能及作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

pLKO.1-puro 慢病毒表達載體與psPAX2 及pMD2.G 質粒(美國addgene 公司)，人肝癌HepG2細胞株與stbl2 感受態細胞(課題組保存)，人胚腎293T 細胞(武漢大學典型保藏中心)，20 bp DNA Ladder 與SYBR?Premix Ex TaqTMII(日本Takara公司)，胎牛血清及DMEN 高糖培養基(Gibco 公司)，陽離子脂質體LipofectamineTM2000、opti-MEM(Invitrogen 公司)，鼠抗人HDAC2 單克隆抗體(Abcam 公司)，LaminB1 抗體(武漢三鷹)，細胞核與細胞漿蛋白提取試劑盒、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔及山羊抗小鼠IgG 二抗和BCA 蛋白濃度測定試劑盒(碧云天)，PVDF 膜(Millipore 公司)，熒光倒置顯微鏡(NIKON)，恒溫培養箱(日本三洋)。其他試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 HepG2 細胞與293T 細胞復蘇后常規培養于含100 mL/L 胎牛血清(FBS)的高糖DMEM 培養基，37 ℃、50 mL/L CO2飽和濕度條件下培養。取對數生長期的細胞進行實驗。

1.2.2 篩選質粒與轉染試劑最適比例 先對脂質體的轉染條件進行優化，選用理論上不會影響細胞生長的對照質粒pEGFP-N1。將質粒pEGFP-N1 轉化stbl2 感受態細胞，用含100 mg/L 卡那霉素的LB 培養基培養質粒pEGFP-N1，挑選單克隆鑒定，搖菌擴大、無內毒素抽提。取對數生長期293T 細胞鋪6 孔板，1×105/孔，培養24 h 使細胞匯合度達70%～90%。實驗分5 組，即質粒pEGFP-N1(μg)與脂質體Lipofectamine2000(μL)以1 ∶1、1∶2、1∶3、1∶4及1∶5的比例轉染人胚腎細胞293T，分別取5 份3 μg pEGFP-N1 溶解至500 μL opti-MEM 中，分別吸取3 μL、6 μL、9 μL、12 μL、15 μL Lipofectamine2000 加入到500 μL opti-MEM，室溫孵育5 min，然后將各組Lipofectamine2000 稀釋液加到相應的質粒中，室溫靜置20 min，將混合物逐滴加入6 孔板，37 ℃、50 mL/L CO2培養8 h 后換成完全培養基，繼續培養24 h、48 h，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達情況。

1.2.3 慢病毒包裝 將前期構建的重組質粒pLKO.1-HDAC2-shRNA 與包裝質粒psPAX2 和包膜質粒pMD2.G 采用脂質體介導法轉染到293T 細胞中，包裝成慢病毒顆粒。于100 mL/L 胎牛血清的DMEM 培養基內，置37 ℃、50 mL/LCO2培養箱中培養。去內毒素大提各組重組質粒pLKO.1-HDAC2-shRNA 和包裝質粒psPAX2 和包膜質粒pMD2.G。轉染前1 天，胰酶消化對數生長期293T細胞，用無抗生素培養基接種25 cm2培養瓶，8×105/瓶培養過夜，使細胞密度達50%～60%匯合度，進行轉染。質粒(μg)∶脂質體(μL)按最優比例，將各組質粒(空載pLKO.1、重組質粒pLKO.1-HDAC2-shRNA1、2、3、neg 8 μg，psPAX2 6 μg，pMD2.G 2 μg)與低血清Opti-MEM 培養基在EP管中稀釋至500 μL，取另一EP 管稀釋48 μL 脂質體Lipofectamine2000 于Opti-MEM 培養基至500 μL，室溫孵育5 min，將含Lipofectamine2000 的混合液加入質?；旌弦褐谢靹?，室溫靜置20 min。用無血清無抗生素DMEM 洗滌293T 細胞兩遍，加入4 mL無血清無抗生素DMEM，然后將1 mL 質粒DNA-脂質體復合物逐滴加到細胞培養瓶中，37 ℃、50 mL/LCO2培養8 h 后，換成無抗生素含100 mL/L 胎牛血清的完全培養基繼續培養;以pEGFP-N1 質粒同步轉染檢測轉染效率。轉染培養24 h 后更換為完全培養基，48 h 收集含慢病毒顆粒的細胞上清液，4 ℃保存。更換新培養基繼續培養，24 h 后第2 次細胞上清液，與第1 次收集的上清液混合，室溫2 000 r/min離心5 min 去除細胞碎片，收集病毒上清液，再經0.45 μm 濾器過濾病毒上清液，分裝，－80 ℃保存備用。

1.2.4 感染靶細胞及細胞形態觀察 取處于對數生長期肝癌HepG2 細胞，以不含抗生素100 mL/L胎牛血清加DMEM 接種至6 cm 培養皿，7×105個/皿，37 ℃，50 mL/LCO2培養24 h，細胞融合率為70%～90%時進行感染。實驗分為6 組:未處理HepG2 細胞組(空白對照組)、空載體對照組(pLKO.1)、陰性對照組(pLKO.1-HDAC2-shRNAneg)、pLKO.1-HDAC2-shRNA 1 組、pLKO.1-HDAC2-shRNA 2 組、pLKO.1-HDAC2-shRNA 3 組。空白對照組不加入任何病毒顆粒換液后繼續培養，空載體對照組、陰性對照組和pLKO.1-HDAC2-shRNA 1、2、3 組細胞中分別加入重組慢病毒顆粒進行細胞感染處理。各感染組先用無血清無抗生素DMEM 洗滌HepG2 細胞兩遍，加入3 mL 無血清無抗生素DMEM，取適量polybrene 加入上述培養基中使其終濃度為5 mg/L，然后將各組2 mL 病毒液逐滴加到細胞培養皿中混勻;37 ℃，50 mL/LCO2培養24 h 后換成無抗生素含100 mL/L 胎牛血清的完全培養基繼續培養;感染48 h 提取RNA 采用實時熒光定量PCR 分析感染后HDAC2 mRNA 水平，感染72 h 后提取細胞核蛋白進行Western blotting 分析。

1.2.5 HDAC2 mRNA 的檢測 pLKO.1-HDAC2-shRNA 慢病毒感染HepG2 細胞48 h 后，提取各組細胞的總RNA，反轉錄為cDNA 為模板應用實時熒光定量PCR 檢測HDAC2 mRNA 的表達情況。HDAC2 基因PCR 引物由上海捷瑞公司合成，上游引物為5'-ATTACTGATGCTTGGAGGAGGT-3'，下游引物為 5'-TATTCTGGAGTGTTCTGGTTTG-3';以GAPDH 為內參，上游引物為 5'-CGCTGAGTACGTCGTGGAGTC-3'，下游引物為5'-GCTGATGATCTTGAGGCTGTTGTC-3'。反應條件為95 ℃30 s，1 個循環;95 ℃5 s，60 ℃30 s，40 個循環;95 ℃，5 s，60 ℃1 min，95 ℃，1 個循環;50 ℃30 s，1 個循環。每組設3 個復孔，實驗重復3 次。以HepG2 細胞組為空白組，根據熒光信號得到Ct 值，根據公式2－△△Ct計算HDAC2 mRNA 的相對表達量。

1.2.6 HDAC2 蛋白的檢測 取感染后72 h 實驗組和對照組細胞，用4 ℃預冷PBS 洗滌細胞，收集細胞并提取細胞核蛋白，BCA 法測定蛋白質濃度，分裝，－80 ℃保存。取20 μg 蛋白加適量2×SDS上樣緩沖液，混勻，沸水浴5 min 預變性，冰上冷卻。經10%的SDS-PAGE 電泳分離后，采用濕轉法電轉移250 mA、2 h，將蛋白轉移至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入HDAC2 一抗(1∶5 000)4 ℃緩慢振搖過夜，TBST 洗膜6 次，5 min/次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1 ∶500)，室溫孵育1 h，洗膜后在暗室內用增強型化學發光(ECL)發光顯色，膠片曝光。取膠片掃描獲取圖像，計算條帶的灰度值作為蛋白的表達量。以LaminB1 作內參照，實驗重復3 次。

1.3 統計學處理

采用SPSS 16.0 統計軟件進行統計分析，計量資料用均數±標準差)表示，組間比較采用完全隨機設計的單因素方差分析，檢驗水準α=0.05，P ＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 質粒與轉染試劑比例優化

當質?！肔ipofectamine2000 為1∶3時，轉染效率能達70%以上。見圖1。

2.2 重組慢病毒顆粒感染后HepG2 細胞形態變化

感染HepG2 細胞72 h 后，在倒置相差顯微鏡下見到對照組HepG2 細胞生長分裂活躍，形態規則，胞核橢圓且位于細胞中央。pLKO.1-HDAC2-shRNA 1、2、3 組HepG2 細胞皺縮，形態多樣，細胞連接消失，胞質密度增加，細胞核固縮，染色質致密，并邊集于核膜內側，胞質中有空泡形成，有凋亡小體產生，可見細胞明顯被抑制。見圖2。

圖1 pEGFP-N1 轉染293T 細胞的熒光表達(200×)Fig.1 Fluorescent observation of EGFP expression of 293T cells after transfection with pEGFP-N1 vector

圖2 自然光下感染的HepG2 細胞形態(72 h)Fig.2 Inverted microscope observation of cell morphology of HepG2 cells 72h in natural light after transfection with recombinant plasmid pLKO.1-HDAC2-shRNA

2.3 慢病毒顆粒感染HepG2 細胞后HDAC2 mRNA 表達及抑制率

慢病毒顆粒感染HepG2 細胞48 h 后，HDAC2基因表達在空載體對照組、陰性對照組與HepG2空白組間，差異無統計學意義(P ＞0.05);pLKO.1-HDAC2-shRNA 1 組、pLKO.1-HDAC2-shRNA 2 組、pLKO.1-HDAC2-shRNA 3 組與空白對照組、空載體對照及陰性對照組比較，HDAC2 基因mRNA 表達量均有下降，差異有統計學意義(P ＜0.05);其中pLKO.1-HDAC2-shRNA 1 組對HDAC2 mRNA 的抑制率最高，達到82.09%。見表1 和圖3。

2.4 慢病毒顆粒感染HepG2 細胞72 h HDAC2 蛋白表達

HepG2 細胞經慢病毒感染72 h 后，在HepG2空白對照、空載體對照及陰性對照組均可見明顯的HDAC2 蛋白表達，但3 組間差異無統計學意義(P＞0.05);包裝的含pLKO.1-HDAC2-shRNA 重組質粒的慢病毒顆粒感染細胞后，pLKO.1-HDAC2-shRNA 1、2、3 組HepG2 細胞中HDAC2 蛋白條帶均較空白對照組、空載體對照組及陰性對照組明顯減弱，組間比較差異有統計學意義(P ＜0.05)，見圖4、圖5;pLKO.1-HDAC2-shRNA 1 組和3 組比pLKO.1-HDAC2-shRNA 2 組的條帶更弱，對蛋白表達的干擾效果更好(P ＜0.05);HDAC2-shRNA 1組與HDAC2-shRNA 3 組比較，差異無統計學意義(P ＞0.05)。

表1 shRNA 對HDAC2 mRNA 的抑制率Tab.1 The suppression rate of HDAC2 mRNA with shRNA

圖3 各組HDAC2 mRNA 相對表達量Fig.3 Relative expression levels of HDAC2 mRNA in the six groups

圖4 pLKO.1-HDAC2-shRNA 轉染后HepG2 細胞中HDAC2 蛋白表達(Western blotting)Fig.4 Protein expression of HDAC2 detected by Western blotting analysis in HepG2 cells transfected with pLKO.1-HDAC2-shRNA

圖5 HepG2 細胞HDAC2 蛋白的表達Fig.5 Protein expression of HDAC2 detected by gray value analysis in HepG2 cells transfected with pLKO.1-HDAC2-shRNA

3 討論

從表觀遺傳學來講，腫瘤的發生主要包括DNA 甲基化、組蛋白乙?；?、染色體重塑和非編碼RNA 調控等。細胞及有機體內組蛋白的乙?；腿ヒ阴；g存在一種受到嚴格控制的動態平衡，是調節基因表達的一個重要因素，這種平衡的打破成為癌癥產生的直接誘因［6］。HDACs 可被募集結合在特定的啟動子區，從而導致許多基因轉錄受抑制，抑制抑癌基因的表達，因此HDACs 可能成為腫瘤治療的靶點。HDAC2 處于信號轉導途徑的下游，有可能在染色體翻譯修飾后對轉錄進行快速調節。研究發現，HDAC2 過表達與p21 的表達降低密切相關，抑制HDAC2 表達能上調p21 的表達和下調細胞周期蛋白cyclinD1 和cyclinA 的表達，提示HDAC2 在維持代謝平衡、調控細胞周期及腫瘤生成中可能發揮著重要作用［7－10］。研究發現，HDAC2 可通過多種機制達到促癌作用，而HDAC2的敲除可導致某些腫瘤細胞生長停滯和凋亡;另外，HDAC2 也可通過抑制抑瘤因子p53，p21 和促進原癌基因MYC 的表達，從而建立阻礙細胞凋亡和細胞周期停滯的惡性循環［11］。

RNA 干擾(RNAi)是在基因的轉錄后針對含有特異性序列的mRNA 進行沉默［12］，RNAi 技術廣泛應用于基因功能分析、信號轉導通路研究和基因治療。由于siRNA 不能在細胞內長期存在，無法實現長時間穩定的RNA 干擾，慢病毒載體則解決了此問題［13］。慢病毒屬于逆轉錄病毒之一，是一種復制缺陷型病毒載體，以HIV21 為基礎發展而得，在宿主細胞內能以自身RNA 為模板在自身反轉錄酶的作用下合成cDNA，再以堿基配對原則合成雙鏈DNA，經環化后整合到宿主細胞的染色體上并長期表達。目前關于經慢病毒載體介導的目的基因沉默研究也日趨成熟。在本課題組前期研究中，通過利用基因克隆技術，成功構建了3 條pLKO.1-HDAC2-shRNA 干擾質粒載體和一條陰性對照載體。采用pLKO.1 慢病毒表達系統，可降低脂質體轉染效率低，瞬時轉染半衰期短的問題，且安全性高、操作性簡單。在本實驗中，由于質粒和脂質體濃度都會不同程度地影響細胞的生長和增殖，為了同時滿足高效轉染率和低細胞毒性，首先利用對細胞無毒性的pEGFP-N1 質粒，選取幾個比例的質粒與脂質體Lipofectamine2000 轉染慢病毒包裝細胞293T，24 h、48 h 后熒光顯微鏡下觀察細胞綠色熒光信號表達強度，獲得最適的質粒與轉染試劑比例進行下一步實驗。本實驗結果顯示，當質粒:Lipofectamine2000 為1∶3時，轉染效率最高，所以本研究的后續實驗根據比例來進行瞬時轉染靶細胞以及包裝慢病毒能達到很好的效果。慢病毒顆粒轉染哺乳動物細胞的效率比質粒載體高，本實驗首先運用脂質體法介導的轉染將構建成功的pLKO.1-HDAC2-shRNA 干擾質粒載體及陰性對照轉染293T 細胞包裝慢病毒顆粒，再感染HepG2 靶細胞，提取總RNA 和蛋白進行驗證沉默效率。Real-time PCR 結果顯示，HDAC2-shRNA 能有效的抑制HepG2 細胞中HDAC2 mRNA 的表達，其中HDAC2-shRNA1 對HDAC2 基因的抑制率高達82.09%，HDAC2-shRNA2 與 HDAC2-shRNA3 對HepG2 細胞 HDAC2 基因的抑制率分別是71.06%、81.25%，說明構建的HDAC2-shRNA 重組質粒在轉錄水平能有效的抑制HDAC2 基因的表達。Western blotting 結果顯示，感染72 h 后，構建的HDAC2 shRNA 能有效地抑制HepG2 細胞中的HDAC2 蛋白表達，與空白對照、空載體對照及陰性shRNA 對照組比較，差異明顯，而空白對照、空載體對照及陰性shRNA 對照組之間表達差異不顯著，提示構建的HDAC2-shRNA 能有效下調肝癌HepG2 細胞中HDAC2 蛋白的表達，進一步證明成功構建HDAC2-shRNA 干擾載體，該研究為后續進行慢病毒包裝及HDAC2 在肝癌中的功能提供理想的研究平臺。

綜上所述，本實驗采用分子克隆技術成功構建了pLKO.1-HDAC2-shRNA 慢病毒載體，并證實了其在肝癌HepG2 細胞中對HDAC2 基因的干擾效果，提示其可有效地沉默肝癌HepG2 細胞中HDAC2 基因的表達，說明HDAC2-shRNA 基因靶點篩選構建的特異性和有效性，該研究為后續進行HDAC2 在肝癌中的功能提供了良好的前期實驗基礎。

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