鐵皮石斛原球莖DoGAUT1和DoPGSIP6基因的克隆及其在不同晝夜溫差下的表達分析

張春　柳賴　鐘雄

摘 要 植物中的糖基轉移酶類能識別不同類型受體，最終生成多糖、復合糖、糖苷化合物等次生代謝產物。為了解其表達及調控機理，本研究利用同源克隆法從鐵皮石斛（Dendrobium officinale）原球莖中克隆了2個糖基轉移酶基因DoGAUT1和DoPGSIP6，分別為2 518、2 010 bp，分別編碼了705、549個氨基酸。生物信息學研究表明，它們同屬于糖基轉移酶家族8中GT-A類的糖基轉移酶，DoGAUT1和DoPGSIP6基因推定的氨基酸序列分別與二穗短柄草，大豆進化關系最近。DoGAUT1為親水性跨膜蛋白，不含信號肽，亞細胞定位于高爾基體。DoPGSIP6為疏水性跨膜蛋白，含信號肽，亞細胞定位于質膜。熒光定量PCR分析表明：DoGAUT1在一定晝夜溫差范圍內，可響應溫度調控，表現出上升趨勢，而DoPGSIP6在晝夜溫差為15 ℃時影響大。

關鍵詞 鐵皮石斛；DoGAUT1基因；DoPGSIP6基因；克隆；晝夜溫差；qPCR

中圖分類號 S682.31 文獻標識碼 A

Abstract Glycosyltransferases（GTs）are able to recognize different kinds of receptors that finally produce secondary metabolites such as polysaccharides， complex carbohydrates and glycosyl compounds in plants. To further understand the biological function and the molecular mechanism， using protocorms as experimental materials， the glycosyltransferases genes of DoGAUT1 and DoPGSIP6 were cloned by homological cloning techniques in Dendrobium officinale. The full length sequences of cDNAs were 2 518 and 2 010 bp， encoding 705 amino acids and 549 amino acids， respectively. Bioinformatics analysis showed that they belonged to glycosyltransferases 8 with the GT-A fold. Amino acid sequence aligenment showed that DoGAUT1 and DoPGSIP6 displayed the closest evolutionary relationships to those of Brachypodium distachyon and Glycine max. DoGAUT1 protein was hydrophilic， without signal peptides and located in the Golgi. DoPGSIP6 protein was a high possibility of hydrophobic membrane protein with the existence of cleavage site for signal peptide in the plasma membrane. The qPCR analysis confirmed that DoGAUT1 gene was on the up trend in a certain day-and-night temperature difference， and DoPGSIP6 gene had the maximum effect with the day-and-night temperature difference of 15 ℃.

Key words Dendrobium officinale； DoGAUT1 gene； DoPGSIP6 gene； Cloning； Day-and-night temperature difference；qPCR

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.02.003

鐵皮石斛（Dendrobium officinale），屬蘭科石斛屬多年生草本植物，野生資源少，主要分布于東亞、東南亞等國家和地區[1]，福建主要集中分布于三明、德化、龍巖等地。鐵皮石斛含豐富的黏性物質，其主要成分是水溶性多糖，具有降血糖、抗腫瘤、提高免疫力等功效[2-3]。因此，從分子水平上適度提高多糖的含量是當前鐵皮石斛育種的一個重要方向。目前國內外對鐵皮石斛多糖的研究主要集中在結構功能研究、成分分析、遺傳標記等方面[4-6]，而從分子水平上對多糖合成過程中相關酶基因的研究較少，對GAUT1和PGSIP6基因的研究集中在擬南芥的Galacturonosyltransferase 小基因家族上[7-9]。GAUT1（α-1，4-Galacturonosyltransferas）和PGSIP6（Glycogenin-like protein 6）分別是多糖（果膠）及葡糖醛酸木聚糖等糖類組分生物合成的關鍵酶[10-11]。近日，美國2所大學的研究人員在植物細胞壁形成問題上有了新的突破，研究人員確認了2種蛋白質，GAUT1和GAUT7共同形成了植物細胞壁中的果膠[12]。PGSIP超家族成員最早認為參與淀粉合成，最近發現該家族中的部分成員參與木聚糖鏈的修飾[11，13-14]。GAUT1和PGSIP6屬于GT8（糖基轉移酶）家族基因，糖基轉移酶參與發育、次生代謝物合成、信號轉導、防御等生物學過程[15-17]。在擬南芥（Arabidopsis thaliana）和水稻（Oryza sativa）中，則分別有同屬于41個GT家族的455和565個基因（http：//www.cazy.org/）（carbohydrate-active enZYmes，CAZy）。但到目前為止，絕大多數擬南芥和其他植物的GTs的功能和生化活性還不清楚。本文克隆鐵皮石斛糖基轉移酶DoGAUT1和DoPGSIP6基因并對其響應晝夜溫差的表達分析，為研究鐵皮石斛多糖合成與DoGAUT1和DoPGSIP6酶活性關系及調控表達提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

鐵皮石斛無菌苗為福建農林大學園藝植物生物工程研究所保存，采自福建連城。

將無菌苗誘導的原球莖放于液體培養基中培養10 d后，取未經溫度處理的原球莖用于DoGAUT1和DoPGSIP6基因的克隆，經不同晝夜溫差處理的鐵皮石斛原球莖提取的RNA用于實時熒光定量PCR（qPCR）操作，晝夜處理溫度分別為25/20、25/15、25/10 ℃。液體培養基的配方為1/2MS+50 g/L土豆汁，其中白糖20.0 g/L，pH值5.8，光照時間12 h/d，光照強度1 200～2 000 Lux，未經處理的溫度為25 ℃。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA的合成 采用Tripure法[16]進行鐵皮石斛原球莖總RNA的提取，提取得到的總RNA經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，經分光光度計檢測其純度。以合格的總RNA為模板，試驗中保守區擴增、3′RACE以及開放閱讀框（ORF）驗證過程中所用的cDNA的合成都是采用RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas）試劑盒，5′RACE 所需cDNA的合成采用System for Rapid Amplification of cDNA Ends，Version 2.0的試劑盒進行，實時熒光定量PCR分析的cDNA合成采用TaKaRa PrimeScript RT reagent Kit（Perfect Real Time，TaKaRa），產物均置于-20 ℃保存。

1.2.2 鐵皮石斛的克隆 參考NCBI上與鐵皮石斛DoGAUT1和DoPGSIP6基因相關序列，在保守區設計簡并引物。根據DoGAUT1和DoPGSIP6基因的測序結果設計3′RACE的2條正向特異引物以及5′RACE的2條反向特異引物，3′末端序列下游錨定引物為AUAP：GGCCACGCGTCGACTAGTAC，5′末端序列上游錨定引物為UPM：CTAATACGACT

CACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT。將獲得的目的基因的5′RACE序列、ORF驗證序列及3′RACE序列采用DNAMAN 軟件進行拼接，得到該基因的cDNA全長，并在ORF外或起始密碼子和終止密碼子處分別設計一對引物用于ORF的擴增。

以反轉錄的cDNA為模板，進行PCR擴增。PCR擴增程序為：94 ℃預變性 3 min；94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸1 kb/min；共35個循環；最后72 ℃延伸10 min，10 ℃保持1 h。PCR擴增產物通過瓊脂糖（1%）電泳進行檢測。采用DNA快速純化回收試劑盒（Solarbio）回收目的片段，以pEASY-T5連接載體，再經轉化大腸桿菌（DH5α）、挑取單克隆、菌液PCR鑒定后，委托北京六合華大基因科技股份有限公司進行測序。所有引物的序列、退火溫度及延伸時間見表1。

1.2.3 生物信息學分析 利用在線ExPASy（http：//www.expasy.org/resources/）蛋白分析軟件Protparam、ProtSite、COIL、SWISS-MODEL分別對蛋白進行理化性質分析，功能位點預測，卷曲結構預測，三維結構預測；利用在線CBS Prediction Servers蛋白分析軟件中的SignalP、TMHMM、NetPhos對蛋白進行信號肽、跨膜結構預測和磷酸化位點分析；利用SignalP 4.1 Server進行亞細胞定位；利用NCBI的Conserved Donain Search在線軟件進行蛋白保守結構域的預測；利用PredictProtein對該蛋白的二級結構進行預測；并利用MEGA5.0軟件構建DoGAUT1和DoPGSIP6的系統進化樹，并用bootstrap法（重復1 000次）評估系統進化樹。

1.2.4 不同溫度處理下鐵皮石斛原球莖DoGAUT1和DoPGSIP6基因實時熒光定量表達分析 本研究以18S rRNA為內參基因，檢測目的基因DoGAUT1和DoPGSIP6的轉錄水平。18S rRNA、DoGAUT1和DoPGSIP6基因擴增引物見上表1。PCR擴增反應體系為20 μL，其中2×SYBR 10 μL，cDNA模板2 μL，上下游引物各0.8 μL，ddH2O 6.4 μL，反應于羅氏LightCycler 480儀器中進行，程序為：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性10 s，59 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，40個循環后，40 ℃冷卻30 s。反應結束后進行擴增曲線和溶解曲線等分析，檢測引物的特異性，各不同溫度處理的cDNA模板混合樣以不同梯度稀釋（5×、25×、125×、375×、625×），進行標準曲線制作，獲得擴增效率等相關參數，以上qPCR反應均重復3次。

2 結果與分析

2.1 鐵皮石斛原球莖DoGAUT1和DoPGSIP6基因克隆及序列分析

以鐵皮石斛原球莖的cDNA第一鏈為模板，經PCR擴增分別獲得2條亮帶，與預期結果一致，測序得序列1長度為1 199 bp，序列2長度為364 bp。以獲得的部分序列為基礎，經3′RACE，序列1和序列2分別獲得577和1 242 bp的片段，經5′RACE，序列1和序列2分別獲得1 031和676 bp的片段。將所獲得的序列1和序列2的3′RACE、保守區序列和5′RACE序列分別進行拼接，而后根據拼接的全長序列設計相應的ORF驗證引物，分別擴增得到2 154和936 bp的片段，測序結果與拼接結果相同。利用DNAman 7.0 軟件對獲得的2個基因全長 cDNA 序列進行分析，序列1的全長為2 518 bp，包含107 bp的5′UTR，2 118 bp的 ORF以及293 bp的3′UTR（含poly A）。序列2的cDNA全長為2 010 bp，包含144 bp的5′UTR，1 650 bp的ORF以及216 bp的3′UTR（含poly A）。測序結果在GenBank 數據庫中在線進行Blast，結果表明：序列1，序列2與已登錄GenBank的多種植物GAUT1和PGSIP6基因高度同源，可認為是鐵皮石斛的GAUT1和PGSIP6基因，命名為DoGAUT1和DoPGSIP6基因，基因已登錄GenBank，登錄號為1740985。

2.2 鐵皮石斛原球莖DoGAUT1和DoPGSIP6基因編碼蛋白質一級序列分析

采用ExPASy Protparam工具對鐵皮石斛DoGAUT1和DoPGSIP6蛋白序列的理化性質進行分析，結果顯示見表2，并且脂溶系數分別為86.62和93.19，一般認為DoGAUT1蛋白為不穩定的脂溶性蛋白，DoPGSIP6蛋白為穩定的脂溶性蛋白。利用ProtScale預測可知DoGAUT1最大的疏水性值為3.344，最大的親水性值為-3.433，預測結果顯示為親水性，而DoPGSIP6最大的疏水性值為3.222，最大的親水性值為-2.500，預測結果說明DoPGSIP6是個小的疏水蛋白。

利用TMHMM Server v. 2.0工具對鐵皮石斛DoGAUT1和DoPGSIP6蛋白的跨膜結構進行預測，如圖1、2所示，結果表明：DoGAUT1可能會在28～50位氨基酸處形成一個跨膜螺旋， DoGAUT1蛋白的跨膜螺旋氨基酸期望值為20.681 79大于18，因此該蛋白很可能是跨膜蛋白。從N末端開始的前60個氨基酸期望值（Exp number， first 60 Aas）為20.673 38，大于10，結合SignalP 4.1 Serve分析，得出該區域是跨膜結構域而非信號肽。DoPGSIP6可能會在377～399、412～434、473～495、500～522位氨基酸處形成跨膜螺旋，DoPGSIP6蛋白的跨膜螺旋氨基酸期望值為117.916 68遠大于18，因此該蛋白很可能是一個跨膜蛋白。從N末端開始的前60個氨基酸期望值（Exp number， first 60 Aas）為2.192 4，小于10，對于含有2個以上跨膜結構域的蛋白，TMHMM認為不含信號肽，運用SignalP 4.1 Server加以分析得出信號肽的位置1～25。綜上表明 DoGAUT1和DoPGSIP6蛋白均為跨膜蛋白（結合TMpred分析），DoGAUT1蛋白不含有信號肽，而DoPGSIP6含有信號肽。

利用COILS對鐵皮石斛DoGAUT1和DoPGSIP6蛋白進行蛋白卷曲螺旋預測，結果顯示：DoGAUT1蛋白的氨基酸序列在190～217，264～293，327～355形成卷曲螺旋的概率分別是0.549，0.604，0.848。而鐵皮石斛DoPGSIP6蛋白在window=14，21和28時，形成卷曲螺旋的預測概率均低于0.5，說明鐵皮石斛DoPGSIP6蛋白不能形成卷曲螺旋結構。

利用NetPhos 2.0 Server預測鐵皮石斛DoGAUT1和DoPGSIP6蛋白的磷酸化位點，結果表明在多肽鏈中可能發生磷酸化的有絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）。DoGAUT1蛋白中以絲氨酸磷酸化位點最多，有26個，預測該位點比較集中的區域序列都是非保守區；其次是酪氨酸，達到6個磷酸化位點，分別為第55、319、500、505、568、690位氨基酸處；蘇氨酸的磷酸化位點有5個，分別在第3、138、245、325、450位氨基酸處。DoPGSIP6蛋白的氨基酸序列發生磷酸化修飾的絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）個數分別23、6和7個。通過Prosite 在線軟件進一步預測鐵皮石斛DoGAUT1和DoPGSIP6潛在蛋白功能位點。結果表明，DoGAUT1蛋白含4個N-糖基化位點、9個蛋白激酶C 磷酸化位點、7個蛋白激酶II 磷酸化位點、4 個N-酰基化位點、1個酪氨酸激酶磷酸化位點、2個cAMP-cGMP依賴性蛋白激酶磷酸化位點。DoPGSIP6蛋白潛在的N-糖基化位點、蛋白激酶C磷酸化位點、蛋白激酶II磷酸化位點、N-酰基化位點、ATP/GTP結合位點基序A（P-loop）位點分別是1、7、6、11和1個，共26個。

2.3 鐵皮石斛原球莖DoGAUT1和DoPGSIP6基因編碼蛋白質二級結構預測及亞細胞定位分析

利用PredictProtein對鐵皮石斛HMGR蛋白的二級結構分析的結果為：DoGAUT1、DoPGSIP6的無規則卷曲所占比例為35.89%、52.46%；α螺旋為56.6%、39.16%；β螺旋為7.52%、8.38%。

運用PSORT軟件對鐵皮石斛DoGAUT1和DoPGSIP6蛋白的亞細胞定位進行預測，結果表明：鐵皮石斛DoGAUT1蛋白定位于高爾基體概率為90%，而DoPGSIP6蛋白定位于質膜的概率為64%，定位于高爾基體概率為46%。

2.4 鐵皮石斛原球莖DoGAUT1和DoPGSIP6基因編碼蛋白質超二級結構分析

通過NCBI-CDS在線軟件分析鐵皮石斛DoGAUT1和DoPGSIP6蛋白的保守結構域，見圖3、圖4，結果發現DoGAUT1蛋白在第394～692 位含有典型的GT8_like_1未知功能的保守結構域，多個配體結合位點、2個金屬離子結合位點。而DoPGSIP6蛋白在第29～276 位含有GT8_Glycogenin保守結構域，多個底物結合位點、2個錳結合位點。它還含有一個保守基因序列DXD，主要負責將不同的糖添加到糖鏈、碳酸鹽、蛋白上。此外，該蛋白在第448～522 位含有CCC1_like保守結構域，它具有固氮的作用。DoGAUT1和DoPGSIP6含有GT8家族的序列相關區域，結構上屬于GT-A類的糖基轉移酶，按糖基化的反應機制，為保留型糖基轉移酶。

2.5 鐵皮石斛原球莖DoGAUT1和DoPGSIP6基因編碼蛋白質三級結構分析

利用SWISSMODEL對鐵皮石斛DoGAUT1和DoPGSIP6蛋白進行分析，得到其三維結構如圖5所示，左圖為DoGAUT1，右圖為DoPGSIP6，可以看出該蛋白的主要結構元件是α螺旋、β折疊和無規則卷曲。

2.6 DoGAUT1和DoPGSIP6蛋白的同源性分析

利用DNANAN軟件分別對DoGAUT1和DoPGSIP6基因推定的氨基酸序列與GenBank上公布的擬南芥Arabidopsis thaliana、二穗短柄草Brachypodium distachyon、黃瓜Cucumis sativus、馬鈴薯Solanum tuberosum，擬南芥Arabidopsis thaliana、短花藥野生稻Oryza brachyantha、番茄Solanum lycopersicum、馬鈴薯Solanum tuberosum、可可Theobroma cacao中的同源序列進行多序列比對。分析結果表明，不同植物的之間均具有較高的相似性，DoGAUT1和DoPGSIP6基因推定的氨基酸相似性分別達到63.01%和73.72%，并且C端都存在一段保守序列，這段序列被稱為PSPG 結構域（圖6、7），該結構域是植物中參與次級代謝產物糖基化的糖基轉移酶的信號模塊。為進一步明確進化關系，采用MEGA5.0軟件構建DoGAUT1和DoPGSIP6的系統進化樹（圖8）。從進化樹結果可以看出，DoGAUT1與單子葉禾本科植物的二穗短柄草親緣關系較近，聚為同一類，而與雙子葉茄科的番茄等植物的親緣關系較遠。DoPGSIP6與蝶形花科的大豆聚為一類，與蕓香科柑橘屬的甜橙關系最遠。

2.7 鐵皮石斛原球莖中不同溫度處理下DoGAUT1和DoPGSIP6基因實時熒光定量表達分析

在溶解曲線、擴增曲線及標準曲線滿足試驗要求的前提下，以18S rRNA為內參基因，檢測鐵皮石斛原球莖中不同溫度處理下DoGAUT1和DoPGSIP6基因的表達水平，其相對表達量見圖9、圖10。DoGAUT1基因在不同溫度不同處理時間下其相對表達量均比對照（0 d）的高；晝夜溫差為10 ℃，是比較理想的處理溫度，隨著處理天數的增加，DoGAUT1的表達量逐漸上升，處理10 d，表達水平最高，是對照的9倍；當晝夜溫差為5 ℃時，處理10 d，效果最好；當溫差為15 ℃，表達相對沒有規律，而且表達量較低。DoPGSIP6基因同樣是在溫差為10 ℃時表達量呈上升趨勢；當溫差為15 ℃，處理2 d時，表達水平約為對照的4倍，而處理10 d后，基因反而比對照低；當溫差為5 ℃時，DoPGSIP6基因幾乎不表達。以上結果表明DoGAUT1、DoPGSIP6基因可能受溫差的直接特異誘導而且與溫差的大小和處理時間相關。

3 討論與結論

3.1 鐵皮石斛DoGAUT1和DoPGSIP6蛋白的結構特點及功能預測

DoGAUT1和DoPGSIP6基因都編碼NDP-sugar轉移酶超家族蛋白，含有GT8家族的序列相關區域，結構上屬于GT-A類的糖基轉移酶，然而它們的蛋白質一級結構并不具有同源性，即使這2個糖基轉移酶基因之間親緣關系的很近，我們也不能準確推斷其生物學功能，研究表明UrdGT1b和UrdGT1c在氨基酸水平上具有91%一致性，但是它們卻轉運不同的己糖[18]。將獲得的鐵皮石斛DoGAUT1和DoPGSIP6推定的氨基酸序列比對分析，發現不同種屬同一糖基轉移酶的同源性極大，這說明酶的進化是相當保守的[19]，進化樹分析表明，DoGAUT1與二穗短柄草親緣關系較近，DoPGSIP6與大豆聚為一類。生物信息學分析，DoGAUT1是親水性跨膜蛋白，DoPGSIP6屬于疏水性的跨膜蛋白，此外DoGAUT1的糖基化位點更多，可能原因是糖基化的發生增加了蛋白的親水性，從側面解釋了疏水蛋白DoPGSIP穩定存在的原因。GAUT1和PGSIP6在擬南芥均定位于高爾基體上[20-21]，預測分析發現，不同的是DoPGSIP6蛋白定位于質膜的概率為64%，定位于高爾基體概率為46%，推測DoPGSIP6蛋白是在高爾基體上完成修飾和包裝，被錨定在膜上。發現在重要功能域方面，鐵皮石斛DoGAUT1酶含有2個金屬離子位點，研究發現當鐵皮石斛鎂等離子含量較高，這些離子對果膠有封閉作用，影響果膠轉化為水溶性果膠[22]，這可能是不同地區鐵皮石斛多糖成分不一樣的原因。與DoPGSIP6所不同的是DoGAUT1具有一個酪氨酸激酶磷酸化位點，提示了該基因可能參與細胞內信號傳導[23]。DoPGSIP6酶含有GT-A型的普遍有的2個相連的“Rossmann”樣的折疊區，具有一個DXD基序，提供錳離子的結合位點，功能是不同的糖添加到糖鏈、碳酸鹽、蛋白上，這可能決定著該基因與修飾多糖合成有關。此外，DoPGSIP6蛋白有CCC1_like保守結構域，該結構域與植物固氮有關，關于DoPGSIP6蛋白是否具有固氮作用有待進一步研究。

3.2 DoGAUT1和DoPGSIP6參與多糖的合成可能受晝夜溫差的調控

多糖的合成酶主要包括合成不同核苷糖的轉換酶和合成多糖的糖基轉移酶。核苷糖通過不同的酶促反應相互轉換，在糖基轉移酶的催化下，合成多糖[24]。從微生物的多糖合成途徑可推測植物中多糖的合成也是相當復雜的[25-26]。而糖基轉移酶作為植物自身防御的第一道防線，能夠不斷緩沖環境壓力并做出適應環境變化的改變，它們在植物次生代謝中具有很高的可塑性，能夠高速周轉[27]。祁秋霞[28]通過對不同溫度條件下的海洋微藻的生物量和多糖含量的研究，實驗結果表明不同的溫度對微藻生長及體內多糖含量的變化有重要的影響，20～25 ℃有利于微藻的生長，10～15 ℃則有利于微藻多糖的積累。粟君等[29]在青錢柳的研究上發現了相對的適溫有利于植物次生代謝物的積累，過高和過低都不利于青錢柳多糖的積累。張宇斌等[30]研究表明溫度對鐵皮石斛的凈光合速率有明顯的影響，在 20 ℃時凈光合速率最大，較有利于鐵皮石斛的生長。李江等[31]在南極菌Pseudoaltermonassp.S-15-13胞外多糖的研究中，發現經過重復的凍融循環后，南極菌S-15-13糖基轉移酶的表達量明顯提高，在第2個凍融循環后，糖基轉移酶的表達量較對照提高了3.667倍。Mancuso等[32]報道從南極海冰和海水中分離的南極菌cAM025EPSs的產量在-2和10 ℃時比其在20 ℃時高出30 倍，南極菌通過提高多糖生物合成酶的表達，以大量合成胞外多糖，從而保護菌體免受低溫及重復凍融的傷害。本研究通過晝夜溫差調控鐵皮石斛DoGAUT1和DoPGSIP6表達分析，表明晝夜溫差為25/15 ℃，DoGAUT1基因表達水平呈直線上升，鐵皮石斛通過DoGAUT1基因的表達合成多糖，該現象符合次生代謝物的積累規律。而DoPGSIP6基因在25/15 ℃處理2 d表達量急劇上升，以大量合成胞外多糖，該多糖的作用可能是保護鐵皮石斛免受低溫的傷害，這與南極菌胞外糖功能類似。

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