黑皮冬瓜LINE逆轉座子RT序列的克隆與特征分析

趙芹等

摘 要 根據LINE逆轉座子逆轉錄酶保守序列設計簡并引物，PCR擴增黑皮冬瓜“B98K”基因組DNA，獲得580 bp左右目的條帶。將PCR產物回收、克隆并測序，獲得23條逆轉酶序列，利用生物信息學軟件分析其長度變異、堿基變化、相似性及系統進化關系。結果表明：這些序列長度在557～593 bp區間變異，同源比對核苷酸序列相似性為39.0%～99.3%，存在高度異質性，主要表現為缺失突變、移碼突變與終止密碼子突變，核苷酸序列聚類分析分為4個家族，家族1與家族2分別包含15和5個成員，占總序列數的65.22%和21.74%。對推導的氨基酸序列分析發現，第12位氨基酸殘基處存在一保守的苯丙氨酸（Phe），多處位置存在半保守氨基酸殘基；氨基酸序列相似性在20.0%～99.5%之間；其中8條序列可能具有轉錄活性，8條與15條序列分別發生移碼與終止密碼子突變。與已知物種構建系統發育進化樹，發現冬瓜LINE逆轉座子RT序列較保守，且與擬南芥、李、油菜等有較近的親緣關系。研究結果為后續利用分子標記研究冬瓜種質遺傳變異及基因組進化奠定基礎。

關鍵詞 黑皮冬瓜；LINE逆轉座子；逆轉錄酶；序列分析

中圖分類號 S642.3 文獻標識碼 A

Abstract Degenerate primers were designed according to the RT conserved motifs of LINE retrotransposons to amplify genomic DNA of black wax gourd“B98K”for investigating and understanding genetic relationship， characteristics and evolution of LINE retrotransposon families from black wax gourd. The PCR products of 580 bp were obtained and cloned to pMD18-T vector， and the positive clones were screened and sequenced. The full-length variation， base composition， homology and phylogenetic relationship of twenty-three different sequences were analyzed by bio-informatics softwares. The results indicated that length of RT sequences concentrated on the region of 557-593 bp， and sequence similarities varied from 39.0%-99.3%. These sequences showed high heterogeneity which was mainly characterized by deletion， frameshift and termination codon mutation. Four families were divided by alignment analyses of nucleotide sequences， and family1 and family2 contained most members of black wax gourd LINE retrotransposons and accounted for 65.22% and 21.74%， respectively. The analysis results of deduced amino acid sequences showed that there is a conservative phenylalanine（phe）in the 12th amino acid residue position of the translated sequences and lots of semi-conservative points appeared in many positions. Eight sequences were found to have transcriptional activity， moreover eight and fifteen sequences presented termination codon and frameshift mutations respectively， and amino acid sequence similarities ranged from 20.0% to 99.5%. The phylogenic tree constructed by these sequences and other RT sequences from GenBank showed that RT sequences of LINE retrotransposons in black wax gourd were conservative， and shared high homology with other species like Arabidopsis， plum and rape， etc. This work offers the basis for developing molecular markers to analyze the genetic variability and research the origin and evolution pathways of black wax gourd.

Key words Black wax gourd； LINE retrotransposons； Reverse transcriptase； Sequence analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.03.004

冬瓜（Benincasa hispida Cogn.）為冬瓜屬一年生蔓性植物，原產中國與印度，現廣泛分布于亞洲的熱帶、亞熱帶和溫帶地區，在中國種植歷史悠久，南北地區分布廣泛[1]。冬瓜易栽培，產量高，耐貯運，保健藥用價值高[2-3]，是華南地區北運和出口創匯的重要蔬菜品種，對調節蔬菜淡季、保證蔬菜周年供應起著非常重要的作用[4]。冬瓜種質資源豐富，但目前對其種質資源分類評價研究較少，前人主要依據生態學性狀或RAPD與ISSR標記開展此類分析[5-7]，而不同種形成與進化之間的關系尚不清楚。源于植物逆轉座子的分子標記已廣泛應用于種質鑒定、圖譜構建和系統進化研究等方面[8-10]，為開展冬瓜種質研究提供了新的視野。此外，冬瓜花色、花型與瓜型及抗性性狀差異很大，但對這些性狀的形成機制尚不明確。據報道逆轉座子易受外界因素激活轉座導致基因突變、基因組擴增及重排等，造成植物遺傳變異[11-14]，在葡萄果皮顏色[15]和菜豆花色形成[16]等方面發揮重要作用，因此明確逆轉座子與冬瓜生物學性狀及遺傳進化間關系具有重要意義。

根據DNA結構特征，逆轉座子可分為長末端重復序列（Long terminal repeat，LTR）和非長末端重復序列（Non-long terminal repeat，non-LTR）兩類。它以RNA為中間產物在寄主基因組內不斷轉座增殖，影響寄主基因組的大小、結構、功能及進化等[17]，大部分逆轉座子在生物及非生物因素脅迫下可被激活[18]，其序列的克隆與分析對解析植物基因組組成、進化及表達調控具有重要意義[19-21]。non-LTR類逆轉座子已在多種植物中進行研究，且開發出不同的分子標記技術[20，22-24]。目前尚未見冬瓜LINE逆轉座子RT序列分離及進一步轉錄活性研究的報道。因此，本研究擬克隆冬瓜LINE類逆轉座子RT片段，利用生物信息學軟件分析其變化特點及與其他物種序列的相似性，以期為冬瓜基因組起源與遺傳進化、種質資源評價提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為黑皮冬瓜“B98K”由廣東省農科院蔬菜所瓜類研究一室保存；冬瓜種子播種至溫室營養盤內，待幼苗長至2片真葉時用于實驗。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取及逆轉錄酶序列PCR擴增 采用改良CTAB法提取冬瓜基因組總DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳及納米紫外分光光度計檢測DNA濃度及純度。

參照Hill等[22]設計擴增LINE逆轉座子RT序列的引物。引物序列為LINE-F： 5′-GGG ATCCNG

GNCCNGAYGGNWT-3′；LINE-R： 5′-SWNARNGG

RTCNCCYTG-3′，其中R=A/G，Y=C/T，S=C/G，W=A/T，N=A/C/G/T。PCR反應體系25 μL，包括DNA 100 ng，10×Ex buffer（含MgCl2）2.5 μL，dNTPs 0.20 mmol/L，1 U Ex Taq DNA聚合酶，引物終濃度為1.0 μmol/L。擴增程序為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35個循環；72 ℃ 10 min。擴增產物在1.2%瓊脂糖凝膠中進行電泳分析。

1.2.2 PCR產物克隆及序列測定 回收純化PCR產物，與pMD19-T vector連接，轉化大腸桿菌DH5ɑ感受態細胞過夜培養，Amp抗生素篩選，挑取白斑利用M13通用引物菌落PCR鑒定陽性克隆，送與廣州英駿生物技術有限公司測序。

1.2.3 逆轉錄酶序列分析 測序序列利用NCBI vecscreen程序去除載體部分，利用NCBI Blastx推導比對獲得RT基因片段及推導的氨基酸序列，應用DNAStar軟件對RT序列長度、堿基組成、G+C含量、氨基酸序列、多重比對等進行分析，結合GenBank報道的其他物種序列構建系統發育進化樹。

2 結果與分析

2.1 冬瓜LINE類逆轉座子RT序列的擴增與序列測定

利用簡并引物在黑皮冬瓜“B98K”中檢測到約580 bp長度的特異片段（圖1），預期大小與其他植物LINE逆轉座子RT序列基本一致[25]，說明該類逆轉座子在冬瓜中普遍存在。

將PCR產物回收克隆，隨機挑取24個陽性克隆測序。經NCBI blastx程序同源搜索發現，23條序列與其它物種non-LTR逆轉座子RT序列具有較高同源性，除BhRT17外，其他序列均含有RT保守域，說明本研究克隆到了冬瓜LINE逆轉座子RT序列，依次命名為BhRT1～BhRT23（表1）。

2.2 冬瓜LINE逆轉座子RT序列同源性分析

DNAStar軟件分析表明，23條RT序列長度并不完全一致，變化范圍為557～593 bp，BhRT12最長，BhRT21最短，其余序列長度在570～583 bp之間（表1與圖2）；堿基分析發現，所有序列富含堿基AT，A、T、C、G數目變化范圍分別為110～198、159～217、117～171和81～111，AT與GC比例為1.26～1.46。由表2可以看出，冬瓜RT序列間相似性在39.0%～99.3%之間，其中BhRT16與BhRT3相似性最高為99.3%，BhRT17與BhRT22相似性最低為39.0%（表2）。由此可見，同一簡并引物擴增所得的逆轉座子RT序列并不一致，在序列長度、堿基變化及序列相似性等方面存在較大差異，表明同一種質內同一類群逆轉座子存在高度異質性，甜菜、牡丹等作物也表現類似特點[25-27]。

2.3 冬瓜LINE逆轉座子RT序列聚類分析

分析23條RT序列構建的系統發育進化樹（圖3）發現，RT序列根據遺傳距離分成4個家族（family 1～4），每組代表由同一祖先而來或親緣關系較近的遺傳家系。其中family 4僅包含一個序列BhRT12，為長度最長的一個序列（593 bp），與其它家族的遺傳距離較遠，單獨列為一族，可能是由于核苷酸序列間的缺失突變造成的；family 1～3分別包括15個、5個和2個序列，family 1與family 2分別占克隆總數的65.22%與21.74%，說明這2個家族是克隆獲得冬瓜逆轉座子RT序列的主要成分；family 1包含的15條RT序列相似性在72.3%～ 99.3%之間，核苷酸序列長度除BhRT8與BhRT21差異比較大外，其余序列表現比較一致，也表現出一定的差異性，主要是由不同程度的點突變、堿基替換及缺失突變造成的；family 1可分為3個亞家族，分別包含9個、3個與3個RT序列，亞家族相似性分別在71.3%～99.3%、64.3%～78.5%與87.0%～99.0%之間，其中BhRT16與BhRT7相似性達99.3%，這可能在進化過程中是由一類逆轉座子發生突變等造成的。family 2分為2個亞家族，分別含有BhRT23、BhRT11與BhRT1以及BhRT18與BhRT22，序列相似性在88.3%～96.4%與96.6%，同樣表現缺失突變、堿基替換與點突變。family 3的BhRT3與BhRT20 RT序列相似性為67.9%。由此可見，堿基替換、點突變或缺失突變都可能是同一家族逆轉座子產生多拷貝群的原因。同時在不同家族包含克隆數的差異，反映了各家族轉座子轉座過程的差異。

2.4 冬瓜LINE逆轉座子逆轉錄酶的氨基酸序列分析

將各RT序列通過NCBI Blastp程序同源搜索，發現與其他物種逆轉錄酶具有較高相似性，據此將23條序列推導翻譯成氨基酸序列，其中BhRT3、BhRT17與BhRT20從第2個核苷酸起始翻譯，其它序列從第3個核苷酸起始；進一步分析表明，第12位氨基酸殘基處存在一保守苯丙氨酸（Phe），推測此位點可能是LINE逆轉座子RT序列中非常保守的位點，另外多處位置存在半保守氨基酸殘基（圖3）；有8條序列（BhRT6、BhRT8、BhRT9、BhRT10、BhRT12、BhRT13、BhRT19與BhRT21）發生移碼突變；15條序列發生不同程度終止密碼子突變，其中8條序列存在3個終止密碼子突變，3條序列存在2個終止密碼子突變，4條序列存在1個終止密碼子突變；另外，8條序列存在轉錄活性（BhRT1、BhRT5、BhRT11、BhRT14、BhRT16、BhRT18、BhRT20與BhRT22），占34.78%，所以移框突變和終止密碼子突變可能是逆轉座子發生突變與不能表達，導致逆轉座子異質性的重要原因（圖4）。

經DNAStar軟件Clustal W同源比對，23條RT氨基酸序列相似性為20.0%～99.5%（表2），BhRT23與BhRT17相似性最低，BhRT19與BhRT9及BhRT16與BhRT5相似性最高。核苷酸序列相似性最低的BhRT13與BhRT18（40.2%），其氨基酸序列相似性并非最低（25.9%），這主要是由于密碼子的簡并性造成的，也充分說明同一來源的逆轉座子異質性較高。對各家族氨基酸序列分析發現，family 1中15條RT序列的氨基酸序列相似性為36.6%～99.5%；famlily 2中5條RT序列相似性為41.1%～95.8%；family 3中2條序列相似性為95.9%；各家族所包含的克隆數越多，序列相似性越高，發生轉座時間越近，具有轉座活性的可能性亦越大。family1～family3包含全部具有轉座活性的逆轉座子，氨基酸序列翻譯也證實了該結論。

2.5 冬瓜LINE類逆轉座子RT序列系統進化樹分析

結合GenBank的13份物種RT序列構建系統發育進化樹（圖5），結果分析表明，來源冬瓜的23條RT序列比較復雜，與李、擬南芥、油菜、可可、甜菜、甜橙、黃瓜等有較高相似性；它們在聚類圖中主要分為5組，18條冬瓜RT序列與黃瓜（Cucumis sativus，XP_004172985）、葡萄（Vitis vinifera，CAN66430）、甜橙（Citrus sinensis，XP_006490008）、濕地松（Pinus elliottii，CAA12932）、水稻（Oryza sativa，EEC80620）等12份植物序列相似性較高，劃分在第1組，第1組約占冬瓜克隆RT序列總數的78.26%，表明冬瓜逆轉座子RT序列具一定保守性；冬瓜RT序列BhRT21單獨形成第2組；第3組包括3條冬瓜RT序列BhRT9、BhRT19與BhRT8；冬瓜序列BhRT2單獨形成第4組，與其它組遺傳距離較遠；而可可（Theobroma cacao，XP_007008704）與其他植物親緣關系最遠，單獨為一分支，為第5組，這4條冬瓜RT序列單獨列為4組，說明冬瓜逆轉座子RT序列具有較高異質性與遺傳變異率。逆轉座子在植物界廣泛分布，作為基因組的組成成分之一，在世代間不僅可以縱向傳遞，還可以橫向傳遞。上述分析表明不同物種中存在著起源相同或相近的逆轉座子，不同種屬間有時存在比種屬內相似性更高的逆轉座子。由此可見，在冬瓜進化史中與上述物種的LINE逆轉座子RT序列間可能存在橫向傳遞現象。

3 討論與結論

冬瓜在中國栽培廣泛，類型品種豐富，對種質資源的鑒評及系統進化研究是加速品種改良和雜種優勢利用的前提。不同分子標記方法開展種質遺傳多樣性研究，各有其特異性與優勢弊端[5-7]。利用逆轉座子RT序列開發分子標記的方法為冬瓜遺傳多樣性分析提供了新的視野。本研究利用LINE逆轉座子RT序列簡并引物，首次從黑皮冬瓜種質中擴增得到目的片段，說明LINE逆轉座子在冬瓜中廣泛存在，為后續研究奠定基礎。

逆轉錄轉座子是植物基因組的重要組成部分，對基因功能與基因組結構有重要影響[28-29]，其序列的克隆和分析對植物基因組學、系統發育學及轉錄組學具有重要研究意義。由于逆轉座子自身轉錄增殖的堿基錯配率高，及長期進化過程中的同源序列重組與生物體防御的互作關系，形成了其高度異質性群體[30]。本研究擴增得到冬瓜LINE逆轉座子RT序列長度差為36 bp，小于牡丹的46 bp，在堿基序列與GC含量方面差異也較大，表現很高的異質性。推斷冬瓜RT序列中存在的不同程度缺失突變、終止密碼子突變與移碼突變，可能是造成冬瓜LINE逆轉座子異質性的主要原因，這與牡丹、甜菜等作物研究結果一致[25-26]。冬瓜LINE逆轉座子RT氨基酸序列存在許多保守與半保守的氨基酸位點，而其他多處的氨基酸位點表現很大的差異性，這可能為進化過程中發生氨基酸突變而形成的。這些都表明冬瓜基因組內LINE逆轉座子是一類較古老元件，其異質性是后來伴隨寄主基因組的進化，在轉座與世代傳遞過程中逐漸積累突變的。

正常的生長發育過程中，植物體內的逆轉座子通常處于靜止狀態，而在受到生物和非生物脅迫后，轉錄活性將被激活[31-35]。多數冬瓜RT序列存在堿基缺失與終止密碼子突變，無終止密碼子的8條序列可能具有轉錄活性，因此推測外部因素激活了冬瓜逆轉座子，發生轉座事件，插入位點發生突變的逆轉座子，以無活性形式存在于基因組中，而活性轉座子可能在其它脅迫下發生遺傳學效應。因此在各脅迫條件下處理冬瓜材料研究逆轉座子的轉座活性，進一步發掘冬瓜各性狀變異與逆轉座子的關系，將對基因組組成進化及優良基因發掘具有重要意義。

逆轉座子不僅可進行世代縱向傳遞，還可進行物種間橫向傳遞，藉此推測逆轉座子的起源、物種的形成及其與物種間的相互關系[36-37]。前人研究表明同一植物內的同一類型逆轉座子序列變異較大，而同一植物類型的逆轉座子保守性較強，有時種內異質性差異大于種屬間[38]。在隨機克隆的23條冬瓜RT序列中，BhRT22與BhRT17一致性只有39.0%，有的甚至與葡萄、擬南芥、濕地松等具有更高相似性，例如BhRT1與李（Prunus persica，XP_

007212886）一致性高達58%，說明這些物種的LINE逆轉座子也表現上述特點，可能是不同物種間逆轉座子橫向傳遞的結果，進一步說明了生物界有共同的起源。這為研究冬瓜系統進化提供了依據。逆轉座子散布在基因組中成為進化的種子，與植物進化關系密切[37]。冬瓜23條RT序列經系統聚類分析，結果將其分為4個家族，不同家族里含有的RT序列數量不同，反映了不同家族逆轉座子轉錄過程存在差異，其存在的歷史地位也可能不同，包含克隆數愈多的家族歷史愈久遠，對冬瓜基因組進化作用也可能各異。

本研究首次從黑皮冬瓜中成功克隆了LINE逆轉座子RT基因序列，為后續轉錄活性研究及開發分子標記鑒評冬瓜種質奠定基礎。

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