茄科植物PAL基因家族的鑒定和序列分析

蓋江濤　陳振璽　王鵬

摘 要 苯丙氨酸解氨酶（PAL，phenylalanine ammonia-lyase[EC：4.3.1.24]）是植物次生代謝尤其是苯丙烷途徑的關鍵酶，與植物抵抗病原菌入侵密切相關，具有重要的植物生理學意義；其催化產物是辣椒素等植物天然產物的前體。采用BLASTP方法，依托全基因組數據庫，獲得了番茄、馬鈴薯、本氏煙草、辣椒等4種茄科植物及楊樹、擬南芥的PAL基因家族成員共27條序列，并對其進行初步的生物信息學分析、理化性質分析及結構分析。結果表明：在進化過程中，茄科植物煙草、番茄、馬鈴薯和辣椒的親緣關系較近，擬南芥、楊樹與茄科植物的親緣關系較遠；酸性蛋白質占96.3%，所有蛋白均為親水性穩定蛋白、有明顯跨膜現象、無信號肽；所有PAL亞細胞定位于細胞質中，具有活性位點的蛋白占96.3%。本研究結果為進一步研究茄科植物中PAL代謝機理提供理論支持。

關鍵詞 苯丙氨酸解氨酶；PAL；基因家族；氨基酸；茄科

中圖分類號 Q949.777.7 文獻標識碼 A

Abstract Phenylalanine ammonialyase（PAL， EC：4. 3. 1. 24）is a critical enzyme in secondary metabolism of plants， which has significant biological relevance and strong ability against bacteria； also， its product provides precursor for plant natural products such as capsaicinoids. In this study， based on the genome database， 27 peptide sequences belonging to phenylalanine ammonialyase gene family were obtained from Lycopersicon esculentum Mill. （syn. Solanum lycopersicum L.）， Solanum tuberosum L.， Nicotiana benthamiana Domin， Capsicum annuum L.， Populus trichocarpa L and Arabidopsis thaliana（L.）Heynh by BLASTP， and analysed by bioinformatics， physico-chemical properties， structural analysis. The analysis showed that tobacco， tomatoes， potatoes and peppers have close genetic relationship， then Arabidopsis thaliana， poplar is further in evolution. Acidic protein is 96.3%. All PAL proteins are located in cytoplasm， hydrophilic， stable， transmembrane， no signal， and 96.3% of the protein has the active site. The anaytical results provide data for the next study of Solanaceae metabolic mechanism.

Key words Phenylalanine ammonia-lyase；PAL；Gene family；Amino acid；Solanaceae

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.03.005

苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase，PAL，EC：4.3.1.24）是一種與植物抗病性相關的酶。它通過催化L-苯丙氨酸（L-Phenylalanine）脫氨生成肉桂酸和氨，進而合成多種具有抗菌作用的產物，是植物體內次生代謝的關鍵酶和限速酶，其酶活性的高低與植物的抗病性密切相關[1]。

植物在遭受冷害[2-4]、傷害[5-6]和病原菌侵染[7]等情況下，PAL活性迅速上升。在馬鈴薯晚疫病[8]、茄子黃萎病[9]、煙草赤星病[10]及煙草受TMV浸染[11]的研究結果中都表明苯丙氨酸解氨酶活性變化和植物抗性關系密切。因此，PAL活性可作為植物抗逆境能力的一個生理指標。

目前，有關PAL基因與茄科植物抗性的研究已有報道，如利用病原菌侵染番茄，植物感病后，結果發現番茄品種的抗病性與其接種后體內PAL酶活性變化呈正相關[12-14]；王萱[1]以不同抗性辣椒品種為材料，研究了辣椒白粉菌侵染過程中PAL與品種抗性之間的關系及不同葉位葉片組織內PAL 活性變化，結果表明辣椒白粉病抗性與PAL活性呈正相關關系，且接種葉片的上、下位葉片組織中PAL活性也均提高，說明接種葉片受白粉菌侵染后會對相鄰非接種葉片產生誘導抗性。此外，它的產物還是辣椒中辣椒素前體香蘭素胺（vanillylamine）合成的第一步關鍵酶[15]。

在模式植物擬南芥中，PAL基因家族有4個基因，分別為PAL1（AT2G37040）、 PAL2（AT3G53260）、 PAL3（AT5G04230）、 PAL4（AT3G10340）[16]。研究報道，PAL1、PAL2和PAL4基因在植物維管系統的木質素合成過程中起作用，PAL3的作用較弱[16]，PAL1和PAL2也在類黃酮生物合成過程中有重要作用[17]。在楊樹中，PAL的活性主要在正在發育的木質部、嫩莖和嫩葉中最高，而老莖和成熟葉中PAL的活性則很低[18]。

本研究以已知PAL基因功能的擬南芥 [Arabidopsis thaliana（Linnaeus）Heynhold]和楊樹[Populus trichocarpa Linnaeus]的PAL序列作為參考，以 4種基因組測序工作已經完成的茄科（Solanaceae）植物番茄（Lycopersicon esculentum Miller， 異名Solanum lycopersicum Linnaeus）、馬鈴薯（Solanum tuberosum Linnaeus）、本氏煙草（Nicotiana benthamiana Domin）和辣椒（Capsicum annuum Linnaeus）作為研究對象，以其全基因組數據庫為依據，通過BLAST的方法獲得了這4種茄科植物PAL基因家族的全部序列，通過系統發育分析、理化性質分析等生物信息學方法分析PAL基因，比較茄科植物中PAL基因家族的特性，為進一步研究茄科植物中PAL基因的功能提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 數據庫搜索

從phytozome V9.1（http：//www.phytozome.net）[19]、茄科植物基因組數據庫（http：//solgenomics.net/）中搜索得到擬南芥、楊樹、番茄、馬鈴薯、本氏煙草、辣椒的PAL基因信息，并下載數據庫中的蛋白序列。

1.2 多序列比對分析

用MAFFT[20]軟件對所得數據進行多序列比對，比對結果保存為fasta格式，并于MEAG6.0[21]中對比對結果進行手動調整。將調整后的序列保存為“.nex”格式以備后續分析。

1.3 系統發育分析

用Mrbayes3.1.2對序列進行系統聚類分析，設置1 000 000代檢測，取樣頻率為1 000，4條Markov鏈，其余參數均為軟件默認值，2次運行，分裂頻率（Split frequencies）小于0.01時終止運行。所得的系統發育進化樹在Figtree version 1.3.1軟件中進行查看、編輯。

1.4 蛋白質的生物信息學分析

用ProtParam tool（http：//web.expasy.org/protparam/）[22]在線工具預測分析蛋白質的理化性質，應用TMpred程序（http：//www.ch.embnet.org/software/TMP-

RED-form.html）在線分析來預測蛋白質跨膜區和跨膜方向，亞細胞定位應用Cell-Ploc 2.0 package軟件（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）進行在線分析。用TargetP 1.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）在線預測氨基酸序列導肽，在signalP 4.1 server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）中完成蛋白質信號肽的預測?；钚晕稽c運用在線分析軟件ExPASy（http：//prosite.expasy.org/）進行分析。

2 結果與分析

2.1 PAL基因家族的系統進化分析

通過BLASTP的方法，去掉重復序列及結構域不完整序列，共得到27條氨基酸序列，其中擬南芥4條、番茄6條、馬鈴薯5條、辣椒4條、本氏煙草3條、楊樹5條。對27條編碼PAL的氨基酸序列進行系統發育分析（圖1）。由圖1可知，這27條PAL基因家族序列聚為明顯的2枝。擬南芥的4個PAL基因、楊樹的5個PAL基因、馬鈴薯的1個PAL基因、辣椒的2個PAL基因、本氏煙草1個PAL基因、番茄的1個PAL基因聚為一枝，說明在進化過程中楊樹、擬南芥的親緣關系較近；而茄科植物番茄的5個PAL基因、馬鈴薯的4個PAL基因、辣椒的2個PAL基因、本氏煙草2個PAL基因聚為一枝，說明茄科植物的親緣關系較近，而且PAL基因的分化在這4種茄科植物物種形成前完成。

在已知的擬南芥PAL基因功能的前提下，可推測出與擬南芥最近的分枝上的5條基因可能具有與擬南芥PAL基因相似的功能，它們是：NbS000

08842g0012.1（本氏煙草）、Solyc05g056170.2.1（番茄）、 PGSC0003DMT400060308（馬鈴薯）、 CA12g15510（辣椒）、 CA05g20790（辣椒）。而另一分支上的13條PAL基因均屬于茄科植物，且在每個物種中均呈現低拷貝，推測這些基因在茄科植物的形成中具有重要的生理功能。

2.2 PAL蛋白的理化性質分析

針對以上鑒定的27條氨基酸序列，筆者對其進行了理化性質分析。結果顯示：除Nbe__NbS000040

18g0009.1為弱堿性蛋白（理論等電點pI=7.29）外，其余蛋白均為酸性蛋白質（理論等電點pI<7），占總蛋白的96.3%（圖2）；根據Guruprasad方法[23]表明，所有蛋白均為穩定性蛋白（不穩定系數小于40）（圖3）；相對分子量除Nbe__NbS00035803g00

15.1為105.38 ku外，其余位于71.84～81.17 ku范圍內（圖4）；所有蛋白均為親水性穩定蛋白 （GRAVY<0），有明顯跨膜現象，均無信號肽。半衰期一致表現為：序列的N-端為甲硫氨酸（Met），在哺乳動物的活體中半衰期30 h，在酵母活體中半衰期大于20 h，在大腸桿菌的活體中半衰期大于10 h。

2.3 PAL氨基酸導肽預測和可靠性分析

導肽（leader peptide）是一段引導新合成的肽鏈進入細胞器的識別序列[24]。在核糖體中合成的蛋白質，只有在正確的細胞部位并裝配成結構和功能的復合體，才能參與細胞的生命活動。因此，導肽的預測和分析對了解蛋白質的亞細胞定位與功能作用途徑和機制有一定的意義。氨基酸序列導肽的預測結果顯示，27條氨基酸序列含有的葉綠體轉運肽（Chloroplast transit peptide，CTP）、線粒體目標肽（Mitochon drial targeting pep-tide，MTP）及分泌途徑信號肽（Signal peptide，SP）的分值均較低，僅煙草基因Nbe__NbS00

035803g0015.1具有線粒體目標肽，其余氨基酸序列均沒有導肽（表1）。

2.4 PAL氨基酸序列的結構分析

3 討論與結論

PAL是連接初級代謝和苯丙烷類代謝、催化苯丙烷類代謝途徑第一步反應的酶，是苯丙烷類代謝的關鍵酶和限速酶，苯丙烷類代謝途徑的產物在植物生長發育過程中起著重要的作用，而這些物質的含量總是與PAL基因的活性密切相關，因此，PAL基因對植物有著非常重要的生理意義，并且也成為重要的研究對象。

本研究對擬南芥、楊樹、番茄、馬鈴薯、本氏煙草和辣椒6種植物共27條PAL基因家族蛋白進行了系統發育分析，結果顯示茄科植物本氏煙草、番茄、馬鈴薯和辣椒的親緣關系較近，擬南芥、楊樹與茄科植物的親緣關系較遠；且鑒定到茄科植物的13條序列與擬南芥、楊樹的PAL基因分別在兩2個分支，推測這些基因可能在茄科植物的形成過程中發揮了特定的生理生化功能。

理化性質分析得出茄科植物PAL基因家族表現出高度的一致性。酸性蛋白質占96.3%，所有蛋白均為有明顯跨膜現象、無信號肽的親水性穩定蛋白，且僅煙草基因Nbe__NbS00035803g0015.1具有線粒體目標肽，其余氨基酸序列均沒有導肽。初步認為4種茄科植物中PAL基因家族編碼的蛋白，不屬于膜蛋白或分泌蛋白，它們由游離的核糖體合成，進入胞質溶膠，參與細胞內生化反應，推測在維持細胞內離子環境，細胞內代謝過程中發揮著重要作用。

結構分析結果顯示，本試驗選定的27條PAL基因中，除 Can__CA12g15510無活性位點外，其余26條PAL基因編碼的蛋白均具有活性位點，從結構上初步認為這26條基因均屬于PAL基因家族。同時，所有PAL基因亞細胞定位于細胞質中，這與已有的PAL基因的亞細胞定位研究結果一致[25]，也進一步說明PAL蛋白為非分泌蛋白，在細胞質內發揮作用。

目前，雖有一些關于茄科植物中PAL基因的研究，但都是對PAL生化活性的研究報道，從茄科植物PAL基因家族層面分析PAL基因的系統進化，并比較茄科植物中PAL基因的性質，還未曾報道。本研究以4種茄科植物PAL基因家族為研究對象，對其序列結構、性質、進化進行分析，為下一步研究茄科植物中PAL基因的功能提供了理論基礎，對今后更好地利用PAL基因對茄科植物進行改造、增強茄科植物的抗性等有推動作用。

參考文獻

[1] 王 萱. 辣椒白粉病抗性與苯丙氨酸解氨酶活性的關系[J]. 中國農學通報， 2009， 25（3）： 193-196.

[2] Kozukue N， Kozukue E， Kishiguchi M. Changes in the contents of phenolic substances，phenylalanine ammonia-lyase（PAL）and tyrosine ammonia-lyase（TAL）accompanying chilling-injury of eggplant fruit[J]. Scientia Horticulturae， 1979， 11（1）： 51-59.

[3] Leng P， Itamura H， Yamamura H. Changes of phenylalanine ammonia-lyase（PAL）activity in twig tissues of two Diospyros species during cold acclimation[J]. Environment Control in Biology（Japan）， 1995.

[4] Leyva A， Jarillo J A， Salinas J， et al. Low temperature induces the accumulation of phenylalanine ammonia-lyase and chalcone synthase mRNAs of Arabidopsis thaliana in a light-dependent manner[J]. Plant Physiology， 1995， 108（1）： 39-46.

[5] Smith B G， Rubery P H. Modifications of wound-induced changes in phenylalanine ammonia-lyase activity in potato tuber tissue[J]. Plant Science Letters， 1979， 15（1）： 29-33.

[6] Brown G E. Changes in phenylalanine ammonia-lyase，soluble phenolics and lignin in injured orange exocarp[M]. Proceedings of the Florida State Horticultural Society， 1990： 234-237.

[7] Zeier J， Pink B， Mueller M J， et al. Light conditions influence specific defence responses in incompatible plant-pathogen interactions： uncoupling systemic resistance from salicylic acid and PR-1 accumulation[J]. Planta， 2004， 219（4）： 673-683.

[8] 王敬文， 薛應龍. 植物苯丙氨酸解氨酶的研究--Ⅱ苯丙氨酸解氨酶在抗馬鈴薯晚疫病中的作用[J]. 植物生理學報， 1982， 8（1）： 35-42.

[9] 孔慶科，殷復偉. 茄子感染萎病菌前后酶活性的動態反應和同工酶變化[J]. 山東農業大學學報：自然科學版， 2001， 32（3）：271-274.

[10] 陳惠明， 黃學躍， 劉敬業，等. 煙草罹赤星病后苯丙烷類代謝途徑有關酶及物質的動態研究[J]. 云南農業大學學報， 1998， 13（1）： 63-66.

[11] Legrand M， Fritig B， Hirth L. Enzymes of the phenylpropanoid pathway and the necrotic reaction of hypersensitive tobacco to tobacco mosaic virus[J]. Phytochemistry， 1976， 15（9）： 1 353-1 359.

[12] Brownleader M D， Ahmed N， Trevan M， et al. Purification and partial characterization of tomato extensin peroxidase[J]. Plant physiology， 1995， 109（3）： 1 115-1 123.

[13] 崔彥玲，張 環. 番茄葉霉病抗性與苯丙氨酸解氨酶的相關性[J]. 華北農學報， 2003， 18（1）： 79-82.

[14] Rasmussen J B， Hammerschmidt R， Zook M N. Systemic induction of salicylic acid accumulation in cucumber after inoculation with Pseudomonas syringae pvsyringae[J]. Plant Physiology， 1991， 97（4）： 1 342-1 347.

[15] Mazourek M， Pujar A， Borovsky Y， et al. A dynamic interface for capsaicinoid systems biology[J]. Plant physiology，2009， 150（4）： 1 806-1 821.

[16] Raes J， Rohde A， Christensen J H， et al. Genome-wide characterization of the lignification toolbox in Arabidopsis[J]. Plant Physiology， 2003， 133（3）： 1 051-1 071.

[17] Olsen K M， Lea U S， Slimestad R， et al. Differential expression of four Arabidopsis PAL genes； PAL1 and PAL2 have functional specialization in abiotic environmental-triggered flavonoid synthesis[J]. Journal of Plant Physiology， 2008， 165（14）： 1 491-1 499.

[18] Subramaniam R， Reinold S， Molitor E K， et al. Structure，inheritance，and expression of hybrid poplar（Populus trichocarpa xPopulus deltoides）phenylalanine ammonia-lyase genes[J]. Plant Physiology， 1993， 102（1）： 71-83.

[19] Goodstein D M， Shu S， Howson R， et al. Phytozome： a comparative platform for green plant genomics[J]. Nucleic Acids Research， 2012， 40（D1）： D1 178-D1 186.

[20] Katoh K， Misawa K， Kuma Ki， et al. MAFFT： a novel method for rapid multiple sequence alignment based on fast Fourier transform[J]. Nucleic Acids Research， 2002， 30（14）： 3 059-3 066.

[21] Tamura K， Stecher G， Peterson D， et al. MEGA6：Molecular evolutionary genetics analysis Version 6.0[J]. Molecular Biology and Evolution， 2013， 30（12）： 2 725-2 729.

[22] Gasteiger E， Hoogland C， Gattiker A， et al. Protein identification and analysis tools on the ExPASy server[M]. Springer： The Proteomics Protocols Handbook， 2005： 571-607.

[23] Guruprasad K， Reddy B B， Pandit M W. Correlation between stability of a protein and its dipeptide composition：a novel approach for predicting in vivo stability of a protein from its primary sequence[J]. Protein Engineering， 1990， 4（2）： 155-161.

[24] 翟中和， 王喜忠， 丁明孝. 細胞生物學[M]. 北京： 高等教育出版社， 2000： 79-240.

[25] Jones D H. Phenylalanine ammonia-lyase： regulation of its induction， and its role in plant development[J]. Phytochemistry， 1984， 23（7）： 1 349-1 359.