甜瓜白粉病離體葉片接種方法研究

鄧麗君　廖新福　王惠林　戶金鴿　楊軍　楊咪

摘要：為了明確新疆吐魯番地區甜瓜白粉病生理小種，試驗采用離體葉片和活體植株2種接種方法，對國際通用的甜瓜白粉病生理小種鑒定的13份鑒別寄主，即MR-l、WMR 29、Iran H、Vedrantais、Edisto 47、Topmark、Nan-tais Oblong、PMR6、PMR5、PMR45、P1124111、P1124112、P1414723進行抗病性鑒定。結果表明，2種鑒定方法在發病率和病情指數上有些差異，但鑒定結果基本一致，初步確定新疆吐魯番地區的甜瓜白粉病由Podosphaera xanthii的小種l所致。因此，離體葉片接種方法可用于甜瓜白粉病生理小種的鑒別和抗源鑒定。

關鍵詞：甜瓜；白粉病；離體葉片；抗性鑒定；種質資源

甜瓜（Cucumis melo L）是葫蘆科黃瓜屬一年生蔓性草本植物。因其栽培周期短、效益高，是致富首選經濟作物之一。甜瓜白粉病是甜瓜生產上最常見、最重要的氣傳病害，從苗期到成株期均可發生，但進入中后期最為嚴重，主要危害葉片，嚴重時亦可危害葉柄和莖蔓。還可導致植株冠層減少，單株坐果率降低，發病嚴重年份可使甜瓜減產50%以上，且甜瓜的成熟度和含糖量也會受到很大的影響。

甜瓜白粉病是由子囊菌亞門白粉菌科白粉菌屬的真菌侵染所致，甜瓜白粉病菌主要為單囊殼白粉菌（Podosphaera xanthii）和二孢白粉菌（Golorino-myces cichoracearum）。國內有關甜瓜白粉病病原菌鑒定結果均表明我國甜瓜白粉病是P.xanthii所致，王娟等嘲初步確定北京地區瓜類蔬菜白粉病由P.xanthii所致，張學軍等報道新疆甜瓜白粉病由P.xanthii所致。甜瓜白粉菌的小種多，分化快，至今已發現P.xanthii存在11個生理小種，即：0、1、2U.S、2France、3、4、5、N1、N2、N3、N4 E4-61。Kuzuva等將N1和N2定名為小種6和小種7；G cichoracearum的生理小種有2個，即小種0和小種1。

防治甜瓜白粉病常用的方法是化學防治法，但化學防治不僅成本高、效率低，還會引起病原菌的抗藥性以及環境污染等問題。多年的防治實踐表明，利用抗源培育抗病品種則是防治甜瓜白粉病最經濟、最有效的措施。培育抗病品種的關鍵步驟之一是生理小種的明確和抗病性的鑒定。由于白粉菌是一種專性寄生菌，只能在活體寄主上存活，目前甜瓜白粉病生理小種的鑒定多采用國際通用的13份鑒別寄主在其苗期使用分生孢子懸浮液噴霧接種法。而苗期噴霧接種受溫度和濕度等外界環境因素的影響較大，常造成鑒定結果不穩定，不能完全反映抗病育種材料的抗性程度。多項研究表明，利用植株離體葉片進行室內抗性接種鑒定，具有快速、準確、篩選量大以及不受季節限制等優越性。而甜瓜白粉病利用離體葉片接種方法鮮有報道。本研究主要探索甜瓜白粉病離體葉片的接種方法，以期為甜瓜白粉病生理小種的鑒別和抗源材料的鑒定提供理論依據。

1.材料與方法

1.1材料

當地易感白粉病甜瓜品種‘巴登的葉片。鄯善當地溫室采集的白粉菌。國際通用的甜瓜白粉病生理小種鑒定的一整套13份鑒別寄主，即MR-1、WMR 29、Iran H、Vedrantais、Edisto 47、Top-mark、Nantais Oblong、PMR6、PMR5、PMR45、P1124111、P1124112、P1414723。所有供試材料均由新疆維吾爾自治區葡萄瓜果研究所提供。離體接種試驗的材料播種于光照培養箱，活體植株接種試驗的材料播種于隔離溫室。

1.2方法

1.2.1病原茵和分生孢子懸浮液制備待感病品種長到3片真葉時，從鄯善溫室采集白粉病發病合適的甜瓜葉片，放入冰盒，帶回實驗室處理。取下感病品種的葉片，留有0.5 cm長的葉柄，用剪刀斜切，自來水沖洗2次，然后用75%（φ）的乙醇浸泡10s，再用蒸餾水晃洗2次，置于7%（ω）次氯酸鈉浸泡消毒10min，然后用無菌水沖洗2次。在超凈工作臺將葉片置于鋪有滅過菌的濾紙的培養皿里，待水吸干后，將葉柄插入裝有培養基的三角瓶中。參考李映霞配制培養基（5‰瓊脂，50mg·Lω^-1苯丙咪唑）。接種前用4℃無菌水將甜瓜葉片上的孢子配制成1×10⁵個·mL^-1的孢子懸浮液。用移液槍取20μL菌液均勻的接種于葉片正面。放入光照培養箱，在白天25℃，晚上20℃、濕度70%、12h光暗交替的條件下培養。接種7d后，觀察發病情況。待發病充分后，取出病葉，將少量4℃滅過菌的蒸餾水沖洗成孢子懸浮液，在顯微鏡下調整分生孢子懸浮液的濃度約為1×10⁵個·mL^-1備用。

1.2.2不同寄主的離體葉片鑒定取13份國際通用的白粉病生理小種鑒別寄主展開的幼葉（第3-第4片葉），在超凈工作臺內，滅菌打孔器將葉片打成1.5cm葉碟，將消毒過的葉碟放人高溫滅菌后的平板培養基中。每個品種處理10片幼葉，3次重復，用移液槍取10μL配置好的菌液接種于葉片正面中心。用封口膜封住培養皿邊口后，放人培養箱培養，在白天25℃，晚上20℃、濕度70%、12h光暗交替的條件下培養。接種7d后開始觀察記錄，在15-20d充分發病后調查發病率和病情指數。離體葉盤法病情分級標準參考劉愛媛的方法，略有修改（表1，表2）。根據調查結果按公式計算出病情指數（DI）：

1.2.3不同寄主的活體植株接種鑒定將13份白粉病鑒別寄主播種于隔離溫室，各5株，3次重復。長到5片真葉時，采用孢子懸浮液噴霧接種法，選在傍晚時間接種。接種時用軟刷將新鮮分生孢子刷人無菌蒸餾水中，加入一滴Tween-20（使之質量分數為0.05%）攪拌均勻，孢子懸浮液的濃度為1×10⁵個·mL^-1，用噴霧器把孢子懸浮液均勻噴霧接種到13個鑒別寄主植物葉片表面，注意葉片不能滴水，接種時間嚴格控制在1h以內，黑暗保濕24h，溫度控制在白天不超過30℃，夜間20℃，相對濕度控制在60%。70%。7d后開始觀察記錄，15～20d充分發病后調查發病情況，進行抗感鑒定。分級標準按照《中國蔬菜病蟲預測預報》的方法”（表3，表4）。

病情指數計算公式同上。

2.結果與分析

2.1病原菌純化和無性階段形態鑒定

三角瓶中的完整葉片生長良好，葉片基本綠色，接種20d后，白色病斑開始連接成片，沒有雜菌，表明甜瓜白粉病菌的分生孢子能夠在感病品種的離體葉面正常萌發并進一步侵染（圖版-1、2）。用滅過菌的接種針挑取少量的粉末在顯微鏡下觀察，發現大量的橢圓形的分生孢子，有發達的纖維體，進一步證實了白粉菌沒有受到污染，且孢子活性較強，適合接種。表明所接種的白粉菌為P.xan-thii。

2.2鑒別寄主離體葉片接種結果

13份寄主離體葉片接種后，部分寄主的葉片先后出現了不同程度的感染，各品種間的發病率和發病指數各異。根據鑒別寄主鑒定情況（圖版-3-15）和鑒定結果（表5）可知，其中Iran H、Vedrantais、Topmark、Nantais Oblong表現為感病，且發病率高；P1124111、P1124112和P1414723雖有發病，但發病率低，表現為抗病；P1124111和P1124112病情指數接近感病；其余品種沒有出現感病現象，均表現為抗病。表5對照甜瓜白粉病生理小種的鑒別寄主及其抗感反應可知，此次采集的白粉病菌為P.xanthii的小種1。

2.3鑒別寄主活體植株接種結果

從表6可以看出，活體植株接種的抗病性鑒定結果與離體接種結果基本一致。但發病率、發病速度和發病程度均高于離體葉片。Iran H、Vedrantais和Topmark發病最為嚴重，表現為高感。NantaisOblong表現為中感。其中P1124111、P1124112、P1414723接種后葉片有發病情況，但發病速度和發病程度均明顯低于其他感病品種，P1414723最后發病。這與離體接種情況表現一致。其他品種沒有出現感病情況，均表現為抗病。對照甜瓜白粉病生理小種的鑒別寄主及其抗感反應表可知，此次采集的白粉病菌主要是P.xanthii的小種1。

3.討論與結論

近年來隨著甜瓜種植面積的增加和設施栽培的發展，白粉病已成為甜瓜主要病害，并呈現生理小種多、分化快的特點。廣泛搜集甜瓜種質資源、篩選抗源、培育和推廣抗病品種是防御白粉病的一條最安全、經濟、有效的途徑，而準確預測甜瓜白粉病菌的種類及其分化和抗病性的鑒定，是開展甜瓜白粉病防治、引進抗源材料和選育抗病品種的基礎。

目前比較常用的人工接種方法是苗期噴霧接種法，但苗期噴霧接種法對發病條件要求嚴格，當栽培季節或環境不適宜時植株不發病或發病不整齊，對抗性鑒定的準確性有一定的影響。此外，苗期接種周期較長，所需成本較高，無法鑒定數量較多的個體植株。鄭耘研究表明，葉碟保存法具有保存菌種純度高，不易受污染，無需隔離設備，不受試驗條件限制等優點。張海旺等”圳研究表明水稻葉片劃傷接種是一種準確、穩定和方便的稻瘟菌接種方法，可用于大規模定性測定水稻抗源及其后代的抗瘟基因型和稻瘟菌的致病型。王倩等研究表明利用激素處理的離體葉片進行早疫病抗性鑒定的方法受到外界環境條件影響相對較小，且需要的時間少，操作簡單，可用于大量新培育馬鈴薯品種的抗病性初步鑒定。張永兵等研究甜瓜蔓枯病離體接種法具有檢測周期短、成本低、可在有限空間鑒定大量材料的優點。離體接種法在水稻、小麥旺”、辣椒和草莓等作物的病原菌生理小種鑒別、抗源鑒定、抗性遺傳規律分析和抗病品種篩選等研究中被廣泛應用。

白粉病菌屬于活體寄生型真菌，因此在普通培養基上無法生存。目前比較常用的人工接種鑒定方法是苗期噴霧接種法，而離體葉片接種法鮮有報道。本試驗離體葉片和活體接種2種方法比較表明，活體接種的發病率及發病指數均略高于離體葉片接種，但兩種方法的鑒定結果一致，新疆吐魯番地區鄯善縣溫室內采集的白粉菌為P.xanthii的小種1。說明用離體葉片接種鑒定甜瓜品種的抗病性是可靠的。離體葉片接種法鑒定抗病性，具有活體整株鑒定法無法比擬的優點，并已在甜瓜蔓枯病及碗豆白粉病等病害研究中得到證實。本研究在甜瓜白粉病鑒定中也得出相似的結論。據此并結合以往的研究成果可以證明，用離體葉片接種以鑒定甜瓜白粉病的抗性，其方法可行，結果可靠。