花生屬種間雜種及其早期多倍體世代生理特性變化研究

摘 要 為了研究花生屬異源多倍體進化過程中的生理特性遺傳變化規律，以花生區組栽野種間雜種F1、早期多倍體世代（S0～S3）及其親本為材料，分析植株葉片中的脯氨酸、丙二醛、可溶性糖和葉綠素含量以及過氧化物酶活性等抗病抗逆相關生理生化指標的變化特征。結果表明，雜種F1代各項生理指標都高于親本，表現出明顯的雜種優勢；染色體加倍后的S0～S1代植株葉片中的POD活性、脯氨酸含量和葉綠素含量均高于F1代，S1～S3代各項生理指標伴隨著自交代數的增加而逐漸降低，但仍高于母本栽培種，說明染色體加倍后的多倍體植株可能具有更強的抗病、抗旱等抗逆和環境適應能力。

關鍵詞 花生；種間雜交；異源多倍化；生理特性

中圖分類號 S565.2 文獻標識碼 A

Abstract To study the mechanisms of genetic variation on physiological property of Arachis allopolyploidization， the variation characteristics of physiological and biochemical indexes related to disease/stress resistance（POD activity， Proline， MDA， soluble sugar and chlorophyll content）was studied using the progenitors， F1 hybrid and early polyploidy generations（S0 to S3）of the hybridization between tetraploid cultivated peanut and diploid wild peanut A. doigoi as materials. The results indicated that：（1）All the five physiological property indexes of F1 hybrid were higher than their progenitors， which showed obviously heterosis；（2）After chromosome doubling， POD activity， Proline and chlorophyll content of S0～S1 were higher than F1 hybrid；（3）All the five physiological property indexes of S1～S3 declined along with the self-cross course but higher than their progenitors， which indicated that allopolyploidy had better environment suitability and resistance capability to disease resistance and drought tolerance. This study provided useful important information for revealing the mechanism of peanut allopolyploidy evolution. Additional， it had vital significance to guide the peanut interspecific hybridization breeding.

Key words Peanut； Interspecific hybridization； Allopolyploidization； Physiological property

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.03.008

多倍化是高等植物基因組的顯著特征之一，多倍體植物中以異源多倍體居多，種間雜交和染色體加倍是形成異源多倍體的主要途徑，通過此途徑形成的異源多倍體兼具雜種和多倍體雙重優勢且克服了遠緣雜種不育的障礙，因而被作物遺傳育種學家廣泛應用于作物品種改良中[1]。異源多倍化不是兩個基因組的簡單融合，而是涉及到大范圍的分子調整和變化[2-6]，從而引起一系列的形態、生理及代謝過程的變化，如黃瓜單位面積的葉綠素a、b及其總含量、MDH的表達量均隨著倍性增加而增加[7]；四倍體何首烏的SOD、POD和APX活性均明顯高于二倍體[8]；三倍體、四倍體西瓜番茄紅素的含量明顯高于二倍體[9]；四倍體玉米籽粒內類胡蘿卜素含量比二倍體增加43%[10]。因此，探明植物多倍體進化過程中的不同倍性材料生理生化水平上的差異不僅對種間雜交育種具有重要指導意義，同時也可為闡明植物多倍體進化機制提供有用的信息[3，11]。

花生屬由3個四倍體種和近80個二倍體種組成，其中的四倍體栽培種花生（2n=40，AABB）是世界上最重要的油料和經濟作物之一。花生屬種間雜交是異源多倍化過程，國內外關于四倍體栽培種花生二倍體祖先的研究比較多，目前認為A.duranensis和A. ipaensis最有可能是栽培種A基因組和B基因組的提供者[12-15]，但就種間雜交異源多倍體進化過程中的相關機制研究甚少，Garcia等[16]和賀梁瓊等[17-19]對該物種種間雜交的回交各世代和早期多倍體世代基因組的遺傳繼承及丟失、基因表達變化進行過報道，目前尚未有該物種異源多倍體進化過程中生理特性變化研究的相關報道。本研究以花生屬四倍體栽培種花生仲愷花4號與二倍體野生種花生A. doigoi雜交產生的種間雜種F1、早期多倍體世代S0～S3及其親本為材料，研究與抗病抗逆相關的生理生化指標在該組合多倍體進化過程中的變化特點，為花生屬種間雜交育種實踐和深入研究花生屬多倍體進化機理提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

花生屬四倍體栽培種花生仲愷花4號和二倍體野生種花生A. doigoi（PI 276235）種間雜交獲得不育的三倍體雜種F1，F1植株經0.2%秋水仙堿誘導加倍處理獲得部分恢復育性的人工異源六倍體S0植株，S0連續自交3代獲得S1、S2和S3等早期異源多倍體世代群體，各世代的植株采取搭建小拱棚過冬和春季扦插幼嫩枝條的方法保存于廣西農業科學院院內基地，每個世代隨機選取7株第4片展開葉[20]進行各項生理生化指標的測定。

1.2 方法

植株葉片中的可溶性糖、脯氨酸含量和過氧化物酶（POD）活性按照李合生[21]主編的《植物生理生化實驗原理與技術》中的方法進行測定，分別采用蒽酮比色法、磺基水楊酸法和愈創木酚法；采用硫代巴比妥方法測定丙二醛含量[22]；葉綠素含量的測定采用KONICAL公司的Chlorophyll meter SPAD-502便攜式葉綠素測定儀自動測量。變異系數CV （Coefficient of Variance）是標準差與均值的比值，通過公式CV=σ/μ計算獲得。

1.3 數據處理

試驗均重復3次，采用Microsoft Excel（Office 2007）軟件處理數據和繪圖，采用 SPSS17.0軟件中Duncan方法進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 種間雜種F1、早期多倍體世代S0～S3及兩親本間POD活性比較

對種間雜種F1、早期異源多倍體世代S0～S3及兩親本植株葉片中的POD活性進行比較（圖1），二倍體野生種花生父本植株葉片中的POD活性為146.54 μmol/（min·g FW），四倍體栽培種花生母本植株葉片中的POD活性為108.51 μmol/（min·g FW），父本植株中的POD活性要高出母本植株38.03 μmol/（min·g FW）；雜交F1代植株葉片中的POD活性為152.91 μmol/（min·g FW），分別高出母本、父本植株44.4 μmol/（min·g FW）和6.37 μmol/（min·g FW）；染色體加倍后，S0代植株葉片中的POD活性為218.46 μmol/（min·g FW），S1代植株葉片中的POD活性為240.59 μmol/（min·g FW），分別高于F1代植株65.55 μmol/（min·g FW）和87.68 μmol/（min·g FW），但隨著自交代數的繼續增加，POD活性不斷下降，到S3代時，其葉片中的POD活性僅為126.98 μmol/（min·g FW）；此外，POD活性變異系數達到28.84%（表1），表明父本、母本和早期多倍體世代間的POD活性存在比較大的差異。差異顯著性分析結果也表明，二倍體野生種花生父本的POD活性與母本、S0、S1、S2代的POD活性差異顯著；母本的POD活性只與S3代的POD活性差異不顯著，與其他世代差異均顯著。

2.2 種間雜種F1、早期多倍體世代S0～S3及兩親本間脯氨酸含量比較

從圖2可以看出，二倍體野生種花生父本植株葉片中的脯氨酸含量為178.46 μg/g，四倍體栽培種花生母本植株葉片中的脯氨酸含量為77.29 μg/g，父本的脯氨酸含量多出母本101.17 μg/g；F1代植株葉片中的脯氨酸含量為217.75 μg/g，分別比母本、父本植株多140.46 μg/g和39.29 μg/g；S0代的脯氨酸含量為218.83 μg/g，S1代的脯氨酸含量為217.86 μg/g，均比F1代植株高出少許；但隨著自交代數的繼續增加，植株葉片中的脯氨酸含量不斷降低，到S3代時，其葉片中的脯氨酸含量僅為95.89 μg/g；植株葉片中的脯氨酸含量變異系數達到39.80%（表1），表明種間雜種F1、早期多倍體世代S0～S3及兩親本植株間的脯氨酸含量存在顯著差異。差異顯著性分析結果也表明，二倍體野生種花生父本脯氨酸含量與四倍體栽培種花生母本、雜種F1及早期多倍體世代S0～S3代植株葉片中的脯氨酸含量都存在顯著性差異；四倍體栽培種花生母本的脯氨酸含量與S3代差異不顯著，但與其他世代植株中的脯氨酸含量差異顯著；F1代與S0、S1代之間差異不顯著，但與S2、S3代間存在顯著性差異。

2.3 種間雜種F1、早期多倍體世代S0～S3及兩親本間丙二醛含量比較

對種間雜種F1、早期異源多倍體世代S0～S3及兩親本植株葉片中的丙二醛含量進行比較（圖3），二倍體野生種花生父本植株葉片中的丙二醛含量為0.012 μg/g，四倍體栽培種花生母本的丙二醛含量為0.007 μg/g，父本植株的丙二醛含量高于母本0.005 μg/g；F1代植株葉片的丙二醛含量為0.021 μg/g，分別比母本和父本多0.014 μg/g和0.009 μg/g；S0代和S1植株的丙二醛含量分別為0.018 μg/g和0.016 μg/g，都少于F1代植株，丙二醛含量并沒有隨著染色體加倍而增加，且隨著自交的進行，丙二醛含量不斷降低，到S3代時，其葉片的丙二醛含量僅為0.011 μg/g；各世代及親本植株葉片的丙二醛含量變異系數達到33.74%（表1），差異顯著性分析結果表明，F1代和S0代的丙二醛含量差異不明顯，但兩個親本的丙二醛含量都與F1代和S0代存在顯著性差異。

2.4 種間雜種F1、早期多倍體世代S0～S3及兩親本間可溶性糖含量比較

從圖4可見，二倍體野生種花生父本植株葉片中的可溶性糖含量為11.87 mg/g，四倍體栽培種花生母本植株葉片中的可溶性糖含量為1.42 mg/g，父本的可溶性糖含量比母本多出10.45 mg/g，遠高于母本；F1代植株葉片中的可溶性糖含量為7.91 mg/g，比母本栽培種高，但低于父本野生種；S0代植株葉片中的可溶性糖含量為8.07 mg/g，S1代植株的可溶性糖含量為8.181 mg/g，均高于F1代；但隨著自交的繼續進行，植株葉片中的可溶性糖含量逐漸降低，到S3代時，其植株葉片中的可溶性糖含量降為5.34 mg/g，但仍高于栽培種母本；植株葉片中的可溶性糖含量變異系數高達44.53%（表1），在所測的生理生化指標中變異系數最大，表明種間雜種F1、早期多倍體世代S0～S3及兩親本植株間的可溶性糖含量存在顯著差異。顯著性差異分析結果也表明，母本、父本的可溶性糖含量與雜種F1、早期多倍體世代S0～S3代都存在顯著差異，但雜種F1、早期多倍體世代S0～S3之間差異不顯著。

2.5 種間雜種F1、早期多倍體世代S0～S3及兩親本間葉綠素含量比較

圖5的數據顯示， 父本野生種植株葉片中的葉綠素含量為32.91 mg/g，母本栽培種植株葉片中的葉綠素含量為33.55 mg/g，父本植株葉片中的葉綠素含量低于母本0.64 mg/g；F1代植株葉片中的葉綠素含量為42.93 mg/g，分別比母本和父本多出9.38 mg/g和10.02 mg/g；S0和S1代植株葉片中的葉綠素含量分別為44.65 mg/g和44.41 mg/g，高于F1植株；但隨著自交的繼續進行，植株葉片中的葉綠素含量也呈現逐漸降低的趨勢，到S3代時，葉綠素含量降至35.51 mg/g；植株葉片中的葉綠素含量變異系數僅為13.33%（表1），表明雙親及各世代間差異不是很明顯。差異顯著性分析結果表明，父本與母本之間差異不顯著，父、母本與雜種F1、早期多倍體世代S0～S1代之間差異顯著，但與S2、S3代之間差異不顯著；雜種F1、早期多倍體世代S0～S1代之間差異不顯著，但與S2、S3代差異顯著；S2和S3代之間的葉綠素含量差異不顯著。

3 討論與結論

過氧化物酶（POD）是廣泛存在于植物體內，能與超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氧酶（CAT）等保護酶系統協同將植物體內的過氧化氫轉化為其他物質，使膜不易膜脂過氧化，起到保護膜脂的作用[23]。脯氨酸不僅是生物大分子的保護劑和羥基的清除劑，還是植物從逆境條件恢復正常生長過程中迅速、有效的氮源、碳源和還原劑，其含量在一定程度上反映了植物的抗逆性[24]。可溶性糖不僅參與滲透調節，還可能參與維持植物蛋白質穩定，調節植物組織的生長、發育和抗逆性等多個生理生化進程[25]。因此，植物體內POD活性、脯氨酸含量和可溶性糖含量的高低從某種程度上反應了植物本身的抗逆性和適應環境的能力。而丙二醛（MDA）被認為是逆境脅迫下膜脂過氧化的最終產物，其含量高低反映了細胞膜脂過氧化的水平，可以反應植物遭受逆境傷害的程度[26-27]。

本研究結果表明，父本植株葉片中的POD活性、脯氨酸含量和可溶性糖含量均高出母本植株，這與野生種花生比栽培種花生具有更強的抗旱、抗病蟲害和抗連作等特性一致，也在生理特性上證明野生種花生具有更強的抗逆性提供了有效證據。但父本植株葉片中的丙二醛含量也比母本植株葉片中的高，這可能是因為野生種花生在其進化初期，由于生存環境惡劣造成了體內丙二醛的積累并被遺傳保存至今，其含量反映的只是它曾經遭受逆境傷害的程度。F1代植株葉片中的POD活性、脯氨酸含量、丙二醛含量和葉綠素含量均高于雙親，這可能與兩個親本雜交后通過全基因組范圍的等位基因和非等位基因之間相互作用獲得的雜合性和雜種優勢有關，使得雜交所產生的雜種F1代在生活力、適應性和競爭能力等方面均超過兩個親本[28]。S0和S1代植株葉片僅有丙二醛含量低于F1代植株，其余的生理指標均高于F1代植株，表明該組合的后代染色體加倍后其多倍體植株具有更強的抗病、抗旱等抗逆能力和環境適應能力，這與普通小麥染色體加倍后適應性方面得到極大改良的研究結果一致[29]。細胞核內染色體組加倍不僅會帶來細胞變大等形態上的變化，多倍體內部代謝和生化過程也會隨之加強[7-9]。

在花生異源多倍體進化早期，各個生理生化指標在各世代及親本間表現出明顯的不穩定性，其中可溶性糖、脯氨酸、丙二醛含量和POD活性變異系數都較大，分別達到了44.53%、39.80%、33.74%和28.84%，這可能是由于在花生異源多倍體進化過程中，其基因組及基因表達模式發生了廣泛而迅速的變化[17-19]，從而引起生理特性也發生了劇烈的變化；此外，隨著自交的進行，S1到S3代植株葉片所測的各項生理生化指標均伴隨著自交代數的增加而逐漸降低，最終都接近母本栽培種，可能與雜種優勢逐漸衰退和偏母性遺傳有關。這些研究結果進一步證明了細胞核內染色體組加倍常帶來細胞變大、抗逆性增強等形態和生理上的變化，種間雜交引起的雜交和多倍化不僅僅是兩個基因組融合在一個細胞核中，而是包括了一系列分子上和生理上的調整[10]。這對指導花生屬種間雜交育種利用野生花生優異基因及闡明花生異源多倍體進化機制具有重要的意義。

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