借助ITS序列用GFP標記巴西橡膠樹棒孢霉落葉病病原菌

劉曉妹等

摘 要 由多主棒孢菌（Corynespora cassiicola）侵染引起的巴西橡膠樹棒孢霉落葉病是影響橡膠樹產膠量的主要病害之一。為了開展該病原菌在活體葉片中的病理學研究，本實驗將綠色熒光蛋白gfp基因表達盒插入了多主棒孢菌經定點突變后的ITS序列中，構建了重組質粒pITGH，并經PEG介導轉化了原生質體，獲得了GFP標記的多主棒孢菌轉化子，所獲得的轉化子經過連續7次轉接培養后仍能在分生孢子、分生孢子梗、芽管和菌絲中穩定地發出強烈的綠色熒光，其生長特性和致病性與野生菌株無明顯差異。

關鍵詞 巴西橡膠樹；多主棒孢菌；綠色熒光蛋白；ITS定點突變；標記

中圖分類號 S432.4 文獻標識碼 A

Abstract Corynespora leaf fall（CLF）disease， caused by the fungal pathogen Corynespora cassiicola， is a major disease of rubber tree（Hevea brasiliensis）that affects the production of natural rubber. The objective of this paper was to provide desired materials for studing pathogenesis on living leaves. The green fluorescent protein（GFP）-expression vector pITGH was constructed by inserting a gfp cassette into rDNA-ITS of site-directed mutagenesis. C. cassiicola protoplasts were transformed by pITGH using a PEG-mediated method. A GFP-tagged transformat was gained. The transformation was efficient， and GFP expression remained stable for at least seven subcultures with fluorescence clearly visible in both the hyphae and spores. The transformed isolate also retained its pathogenicity and growth pattern， both similar to those of wild type. This result would be useful for understand biology，observing infection process， predicting the CLF disease and evaluating resistance of H. brasiliensis to C. cassiicola by means of leaf colonization studies.

Key words Hevea brasiliensis； Corynespora cassiicola； GFP； rDNA-ITS of site-directed mutagenesis； Marker

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.03.022

巴西橡膠樹是重要的熱帶作物之一，其產品天然橡膠與鋼鐵、石油、煤炭并列為四大工業原料。由多主棒孢菌[Corynespora cassiicola（B. & C.） Wei]侵染引起的巴西橡膠樹棒孢霉落葉病是影響橡膠樹產膠量的主要病害之一[1]。該病菌能侵染為害280多種植物[2]。關于該病菌的生物學特性、遺傳多樣性以及病害防治等方面已開展了較多研究[3-4]，而且已深入到分子研究水平，已報道了4個致病相關基因CCK1[3]、CMP1[4]、CCHog1[5]和cas[6]，但有關該菌GFP標記的研究國內外尚未見報道。

與傳統的組織印跡法、放射性標記核酸探針法、GUS染色法等非活體檢測方法相比，綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）因發光穩定、對活細胞無傷害和不需添加外源底物，就可以在活細胞中實現實時動態監測等優點[7]，利用GFP標記靶標植物病原菌成為了目前研究病原菌與寄主之間互作的重要手段[8]，迄今已標記成功的植物病原菌有芒果尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）[9]、芒果畸形病病菌（Fusarium proliferatum）[10]、香蕉、西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）[11-13]、稻曲病菌（Ustilaginoidea virens）[14]、棉花黃萎病菌（Verticillium dahlia）[15]、西瓜細菌性果斑病菌（Acidovorax citrulli）[16]等，極大地便利了這些病原菌在定植、組織侵染過程及品種侵染差異性等方面的研究。GFP也被廣泛用于標記病原菌的致病相關基因[17-18]，為研究其時空表達特點，揭示病原菌致病機理提供了有利的手段。為了在活體寄主上研究多主棒孢菌與巴西橡膠樹葉片的互作關系，本研究擬通過定點突變ITS序列和PEG介導途徑，將多主棒孢菌構建成了能發出綠色熒光的標記菌株，以期為下一步研究該病菌在活體橡膠葉片上的生物學、侵染過程、預測病害和篩選抗病品種等打下良好的材料基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試病原菌和質粒 巴西橡膠樹棒孢霉落葉病病原菌多主棒孢菌[Corynespora cassiicola（B. & C.）Wei]單孢菌株CC004，由中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所提供。潮霉素B（HmB）抗性基因hygB來源于質粒pCT74[8]，由美國Oregon大學Ciuffetti博士提供。

1.1.2 供試藥劑和培養基 Fungal gDNA Kit、Mini Plasmid Kit為BioMiga產品；pMD18-T simple vector、E. coli JM109、X-Gal、IPTG、XhoⅠ、EcoRⅠ、Marker DL 2 000、Marker DL 15 000均為TaKaRa產品；2×HS Taq-Mixture Kit、TIANgel Midi Purification Kit為TIANGENE產品。潮霉素B為Roche進口分裝，Ampicillin為Amresco進口分裝。溶壁酶購自廣東省微生物研究所。用于制備PDA、PDS、PD培養液、LB培養基的試劑為國產分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 GFP標記多主棒孢菌的策略與方法 從pCT74質粒上酶切hygB：：gfp片段需要限制性內切酶XhoⅠ（CTCGAG）和EcoRⅠ。在CC004菌株的ITS序列上[4]，只存在EcoRⅠ，而無XhoⅠ位點，但在第324～329位點有與XhoⅠ位點相似的序列TTCGAG，若通過設計引物（5ITG-F/5ITG-R、3ITG-F/3ITG-R、C-ITG-F/C-ITG-R），將該位點的堿基T定點突變為C，即可獲得含XhoⅠ酶切位點的ITS新序列（命名ITG）。將ITG克隆至pMD18T-simple vector上（pITG），再用XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切pITG和pCT74，回收線性化pITG和hygB：：gfp片段，通過T4連接酶將hygB：：gfp插入pITG，即可獲得重組質粒pITGH。再用pITGH轉化CC004菌株原生質體，因其hygB：：gfp兩側為ITS部分序列，所以可通過同源重組將hygB：：gfp整合入CC004菌株的ITS序列上，最終獲得gfp標記的多主棒孢菌（圖1）。引物見表1，擴增體系（50 μL）：2×HS Taq Mixture 25.0 μL，上/下游引物（10 μmol/L）各2.0 μL，模板1.0 μL（擴增5ITG和3ITG片段時以CC004菌株總DNA為模板，擴增ITG片段時以回收的5ITG和3ITG產物為模板），ddH2O 20.0 μL。5ITG、3ITG、ITG片段擴增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，退火溫度（Tm）及時間（t）見表1，72 ℃ 1.5 min，35個循環；72 ℃ 10 min。gfp檢測程序：96 ℃ 4 min；94 ℃ 50 s，58 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，30個循環；72 ℃ 10 min。其余操作見相應試劑盒。

1.2.2 重組質粒pITGH的PCR鑒定 用pMD18-T simple vector通用引物RV-M/M13-47檢測，并將符合預期的重組質粒寄往深圳華大基因科技服務有限公司測序，進一步證實序列的正確性。

1.3 pITGH轉化多主棒孢菌菌株CC004原生質體

1.3.1 CC004菌株對潮霉素B的敏感性測定 在含20、30、40、50、60、70、80 μg/mL的Hm B的PDA培養基上接種菌餅，28 ℃培養7 d，確定Hm B對CC004菌株的最低抑菌濃度。

1.3.2 CC004菌株原生質體制備及其PEG介導的轉化與再生 參考劉曉妹[3]的方法，制備CC004菌株原生質體，使其濃度為2×107～3×107個/mL，立即轉化，即在10 mL無菌尖底離心管中，加入100 μL原生質體、40 μL pITGH質粒、50 μL 2×STC溶液，輕輕混勻后，冰浴20 min，加入2 mL 60% PEG 4000溶液，輕輕混勻，室溫放置10～20 min，再加入適量PDS 再生培養液，使最終總體積為5 mL，輕輕混勻，封口后在28 ℃培養箱光照培養36 h，取1 mL涂抹于含80 μg/mL Hm B和適量鏈霉素的PDS平板上，共涂抹5皿，28 ℃黑暗培養10～15 d后，挑取單菌落在激光共聚焦顯微鏡下鏡檢熒光。

1.3.3 GFP標記菌株的熒光穩定性檢測 選擇綠色熒光最強的菌落，單孢純化后在不含Hm B的PDA培養基上連續7次轉接培養，在培養的初期（2 d）、中期（5 d）和后期（10 d），鏡檢其熒光穩定性并拍照。

1.3.4 GFP標記菌株的PCR鑒定 先用gfp基因特異性引物P28、P29檢測1.3.3獲得的單孢菌株，再從插入片段的外側ITS序列上設計引物，即標記菌株特異性檢測引物ITSHG-F/ITSHG-R，檢測并測序擴增產物，以證實hygB：：gfp基因插入了標記菌株的ITS序列中。

1.3.5 GFP標記菌株的菌落形態觀察和致病性測定

將標記菌株和野生型菌株在不含Hm B的PDA培養基上28 ℃培養5 d后，觀察菌落形態和大小。再用無菌水洗下配成2 000個孢子/mL的懸浮液，刺傷接種巴西橡膠樹感病品種‘RIM600嫩綠色葉片，28 ℃保濕培養，定時觀察。用無菌水作空白對照。每處理重復5片葉。

2 結果與分析

2.1 多主棒孢菌菌株CC004的5ITG、3ITG和ITG片段擴增結果

圖2表明，5ITG、3ITG、ITG擴增條帶的大小分別約為230、280、480 bp ，符合預期。測序表明：大小477 bp的ITG序列在第210位點（ITS第324位點）的堿基T被突變為了堿基C，具備了XhoⅠ的酶切位點。

2.2 重組質粒pITGH的PCR鑒定

用引物M13-47和RV-M從重組質粒pITGH上擴增獲得約3 400 bp的片段（圖3），說明hygB：：gfp（3.0 kb）片段已插入了ITG（477 bp）的XhoⅠ和EcoRⅠ酶切位點之間，測序表明重組質粒pITGH-3序列完全正確，可以用于后續轉化。

2.3 gfp基因轉化多主棒孢菌菌株CC004原生質體

2.3.1 CC004菌株對潮霉素B的敏感性測定

CC004菌株在含Hm B的PDA平板上培養7 d，結果表明：Hm B對CC004菌株的最低抑菌濃度為80 μg/mL。

2.3.2 GFP標記菌株的熒光穩定性檢測 連續7次轉接培養后，用激光共聚焦顯微鏡觀察GFP標記菌株，仍可在培養初期、中期和后期的分生孢子及其萌發的芽管、分生孢子梗以及菌絲體中觀察到強烈的綠色熒光（圖4）。說明gfp基因在CC004菌株中能穩定遺傳和表達。

2.3.3 GFP標記菌株的PCR鑒定 提取轉化子菌株基因組DNA后，用gfp特異性引物P28/P29進行PCR檢測，得到約400 bp的預期片段，而在野生菌株中未擴增出此條帶（圖5），可見gfp基因已整合到了轉化子基因組中。再用標記菌株特異性檢測引物ITSHG-F/ITSHG-R檢測，在轉化子和野生菌株中分別擴增到約3 300 bp和520 bp的預期片段（圖6），說明轉化子得到了完全純化，且hygB：：gfp基因插入了標記菌株的ITS序列中，此結果被擴增產物的后續測序結果進一步得到了證實。

2.3.4 GFP標記菌株的菌落形態觀察和致病性測定

由圖7可以看出，GFP標記菌株與野生型的菌落形態和大小略有差別，但差異不明顯；其致病性與野生型菌株也無明顯差別，均能引起典型壞死斑（圖8），說明本試驗用GFP標記CC004菌株獲得成功。

3 討論與結論

本研究結果表明，經轉化的菌株在選擇壓為80 μg/mL的Hm B 平板中央都長出了菌落，幾乎都能發出綠色熒光，轉化成功率約100%。然而，在培養基邊緣，尤其是培養皿壁上長出的菌落基本上都不發光，可能與倒平板時在邊緣或壁上產生的冷凝水不含Hm B有關。因此，建議篩選時應以平板中央為主，或涂板時注意，要盡量在平板中央小范圍涂抹，以免濺入冷凝水中生長，造成假陽性。

人們普遍采用含綠色熒光蛋白基因gfp的載體如pCT74轉化目標菌的方法來標記目標菌[9-10，12]，但其隨機性強，有可能會將gfp基因插入到目標菌的一些功能基因組上而破壞了這些基因的正常表達和調控，進而影響到后續研究數據的準確性。rDNA-ITS序列是真核生物核糖體上5.8 S rDNA和18 S rDNA之間的插入間隔序列，為冗余功能的保守重復序列。本研究利用定點突變改造ITS序列后，構建了gfp標記載體pITGH，借助該載體上兩側的ITS部分序列，通過同源重組將hygB：：gfp基因標記到CC004菌株的ITS序列上，不僅充分利用了ITS多拷貝、易克隆等優點、提高了標記成功率，同時又降低了因隨機插入產生不良影響的概率，所獲得的標記菌株更能代表野生型菌株的原始特性，值得推薦。

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