富碳條件下蛋白核小球藻的生長及其對油脂的積累

黃建鋒等

摘要[目的]研究富碳條件下蛋白核小球藻的生長及其對油脂的積累。[方法]通過外加乙酸鈉的方法形成小球藻生長的富碳環境，研究小球藻在富碳條件下的生長及其對油脂的積累。[結果]外加一定量的乙酸鈉能明顯促進蛋白核小球藻的生長（P<0.01），顯著提高小球藻中的油脂含量（P<0.01）。[結論]該研究可為小球藻的應用開發及富營養化廢水的凈化利用提供參考。

關鍵詞蛋白核小球藻；富碳；乙酸鈉；生長；油脂積累

中圖分類號S181；TS201.1文獻標識碼A文章編號0517-6611（2015）29-243-02

富營養化養殖廢水富含碳、氮、磷等營養元素和有機質，如不經處理直接外排，不僅會導致這些營養元素的流失和浪費，還會造成周邊水體的富營養化，引發赤潮等一系列環境污染問題。

小球藻（Chlorella）屬綠藻門、綠藻綱、小球藻屬。它能夠吸收、利用水體中的碳、氮、磷等營養元素和有機質進行生長，具有生存能力強、生態分布廣、生長效率高等特點，被認為是生物柴油中最具開發潛力的原料之一。同時，小球藻還富含蛋白質、多糖、維生素及多種生物活性物質，具有抗腫瘤、抗病毒、提高免疫力等多種活性，在食品添加劑、動物飼料及醫藥保健等領域有廣泛用途。因此，利用富營養化廢水培養小球藻，不僅能凈化這些廢水，而且收獲的小球藻還可用于生物柴油、相關食品的開發，這既降低了廢水的處理費用，也進一步降低了小球藻的生產開發成本，能起到一舉兩得的作用。

該研究以蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）為研究對象，采用外加碳源（乙酸鈉）的方法形成小球藻生長的富碳環境，通過研究小球藻在富碳條件下的生長及其油脂含量的變化，以了解小球藻對相關碳源的利用及其對油脂的積累，為小球藻的應用開發及富營養化廢水的凈化利用提供參考。

1材料與方法

1.1藻種和培養液

試驗所用藻種為蛋白核小球藻，為集美大學水產學院環境保護與資源利用實驗室培養藻種。所用的培養液為f/2天然海水培養液，其基本組成為NaNO3 74.8 mg/L，NaH2PO4 4.4 mg/L，Na2SiO3 10 mg/L。天然海水取自廈門集美龍舟池養殖場，經漂白粉消毒和硫代硫酸鈉調pH至7.0后，可用于上述培養液的配制。

1.2試劑與儀器

漂白粉為市售水產用消毒劑，85%濃H2PO4，98%濃H2SO4，香草醛磷酸溶液濃度為1.978 mg/ml，其余試劑均為分析純。

UV1100型紫外可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）；OLYMPUSCX37型生物顯微鏡（上海尚光顯微鏡有限責任公司）；BS110S型電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）；H1650臺式高速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；YXQLS30SII立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實業有限公司）；PGX280光照培養箱（寧波萊?？萍加邢薰荆?。

1.3試驗方法

通過前期研究，該研究選擇乙酸鈉為外加碳源，并選擇1.6 g/L的碳濃度或9.06 g/L的CH3COONa·3H2O為外加碳源的添加濃度。試驗分為對照組和富碳組，兩組中均接種有相同來源和數量的小球藻。對照組中的培養液為f/2培養液，富碳組的培養液是在f/2培養液中添加外加碳源乙酸鈉，并使培養液中的碳濃度達到1.6 g/L（不包括培養液中CO2的碳）。將對照組與富碳組小球藻放置于光照培養箱中培養，光照強度為10 000 lx、溫度為25 ℃、光暗比為12 h∶12 h，每天定時取樣，分別測定小球藻在680 nm波長下的OD值、細胞數以及培養液中乙酸鈉的濃度。觀察培養10 d，最后收獲小球藻，烘干至恒重后，測定小球藻中的油脂含量。

1.4測定方法

培養液中乙酸鈉濃度采用氫氧化鈉化學滴定法進行測定，小球藻中脂肪含量采用香草醛比色法 進行測定。

1.5統計分析

試驗數據采用excel軟件中的t-檢驗函數進行差異性分析，P<0.05為顯著差異，P<0.01為極顯著差異。

2結果與分析

2.1富碳條件下小球藻的生長

分別采用OD法和細胞數法測定了小球藻在富碳條件下（添加乙酸鈉）的生長曲線，兩種方法都表明小球藻在富碳條件下的生長明顯好于對照組（圖1），且達到了統計學上的極顯著水平（P<0.01）。10 d時間，富碳組小球藻的OD值和細胞數都增長了近4倍，平均每天增長38%或172萬cells/ml，而對照組平均每天僅增長7%或32萬cells/ml。此外，不論是對照組還是富碳組，兩種方法得到的小球藻的生長曲線都極其相似，呈現出較好的一致性。

2.2富碳條件下小球藻對外加碳源的利用

富碳條件下，隨著小球藻的OD值從0.2增加到0.9，培養液中的乙酸鈉含量也逐步降低，最終降低到初始乙酸鈉濃度的47%（圖2）。說明培養液中有53%的乙酸鈉已被小球藻利用，平均每天利用5.3%或0.085g/L的碳，這也進一步說明蛋白核小球藻能較好地吸收利用乙酸鈉進行生長。

通常情況下，小球藻是利用水體中的二氧化碳實現其自養生長。在25 ℃、1個大氣壓下，水中二氧化碳的溶解度為0.031 3 mol/L。也就是說，在沒有外加碳源的條件下，培養液中的碳濃度僅為0.375 6 g/L。而在添加乙酸鈉的富碳條件下，培養液中的碳濃度達到1.6 g/L，是小球藻正常自養條件下的4.26倍，這為小球藻的生長提供了充足的碳源。

研究表明，小球藻不僅能利用水體中的二氧化碳進行自養生長，還能利用葡萄糖、乙酸鈉等外加碳源，在富碳條件下進行異養和混養生長。但不同外加碳源對小球藻生長的影響不盡相同。葡萄糖能促進小球藻的生長，而乙酸鈉對小球藻生長的影響似乎存在一定爭議。牛海亞等的研究表明，乙酸鈉能促進小球藻的生長；蔡佳佳等發現，在低碳缺硫的培養基中，乙酸鈉能明顯促進小球藻生長；該研究也表明乙酸鈉對蛋白核小球藻的生長是有促進作用的。但劉香華等的研究則發現，在特定培養條件下，乙酸鈉并不利于普通小球藻（Chlorella vugaris）的生長。造成這種差異的原因也許可能與小球藻的藻種類型及相關的培養條件有關。

2.3富碳條件下小球藻對油脂的積累

富碳條件下，蛋白核小球藻中的油脂含量比對照組有了明顯提高（圖3），且達到統計學上的極顯著水平（P<0.01），表明外加乙酸鈉對蛋白核小球藻的油脂積累有較好的促進作用。

油脂含量是小球藻開發作為生物柴油的一個重要指標。不同藻種、不同培養方式和培養條件對小球藻中的油脂積累都有重要影響。目前發現，原始小球藻（Chlorella protothecoides）、普通小球藻和蛋白核小球藻等多個小球藻藻種都具有較好的油脂積累能力，在某些特定條件下小球藻中的油脂含量最高都可達到干重的50%以上[12-15]。不過，小球藻的油脂含量受培養方式、培養條件等環境因素影響較大。通常在有外加碳源的異養和混養條件下，小球藻的油脂含量要明顯高于自養條件下的小球藻。該研究也表明，添加乙酸鈉的混養條件下，小球藻的油脂含量比自養條件下有顯著的提高。還有研究表明，通過改變培養基配方等方式，小球藻的油脂含量可從10%左右提高到40%以上，能提高3倍以上。因此優化培養基配方、優化培養條件對于提升小球藻的油脂含量具有重要意義。

3結論

外加一定量的乙酸鈉能明顯促進蛋白核小球藻的生長（P<0.01），明顯提高蛋白核小球藻中的油脂含量（P<001），這將進一步提升小球藻在富碳條件下的油脂產量，有助于其生物柴油的開發。小球藻在富碳條件下能較好地利

用乙酸鈉，其對乙酸鈉的利用率為每天0.085 g/L，而小球藻則以每天172萬cells/ml的速度增長。

參考文獻

[1] 金城.小球藻生產生物柴油的研究[J].微生物學通報，2010，37（8）：1258.

[2] 孔維寶，李龍囡，張繼，等.小球藻的營養保健功能及其在食品工業中的應用[J].食品科學，2010，31（9）：323-328.

[3] 陳明耀.生物餌料培養[M].北京：中國農業出版社，1995.

[4] 顧良忠，張樹榮.化學滴定測定醋酸鈉含量的新方法[J].廣西輕工業，2010（8）：32.

[5] 叢峰，孫雪，徐年軍.幾種小球藻油脂含量檢測方法的比較及優化[J].寧波大學學報（理工版），2012（1）：20-23.

[6] 袁長波，楊家振.278.15至318.15K下二氧化碳在氯化鈉葡萄糖水溶液中的溶解度和活度系數[J].高等學?；瘜W學報，1993（1）：80-83.

[7] 牛海亞，馬玉龍，石勛祥，等.小球藻適宜碳源及營養方式研究[J].湖北農業科學，2013（24）：6030-6033.

[8] 劉香華，劉雷，曾慧卿.不同碳源及光照對小球藻生長和產油脂的影響[J].安全與環境學報，2012（3）：6-10.

[9] 謝林靜，韓宇馳.不同有機碳源對小球藻的生長與產油量的影響[J].湖南環境生物職業技術學院學報，2013（4）：8-11.

[10] 楊素玲，孟佑婷，劉桂君，等.小球藻自養、異養和混養特性的研究[J].安徽農業科學，2013（18）：7748-7749.

[11] 蔡佳佳，費小雯，李亞軍，等.元素缺乏和外加碳源對小球藻（Chlorella sp KMMCC FC-21）生長和油脂積累的影響[J].熱帶作物學報，2011（11）：2029-2036.

[12] YAN D，LU Y，CHEN Y F，et al.Waste molasses alone displaces glucose-based medium for microalgal fermentation towards costsaving biodiesel production[J].Bioresour Technol，2011，102（11）：6487-6493.

[13] RISMANIYAZDI H，HAMPEL K H，LANE C D，et al.Highproductivity lipid production using mixed trophic state cultivation of Auxenochlorella（Chlorella）protothecoides[J].Bioprocess Biosyst Eng，2015，38（4）：639-650.

[14] TRAN D T，CHEN C L，CHANG J S.Effect of solvents and oil content on direct transesterification of wet oilbearing microalgal biomass of Chlorella vulgaris ESP31 for biodiesel synthesis using immobilized lipase as the biocatalyst[J].Bioresour Technol，2013，135：213-221.

[15] GOUVEIA L，OLIVEIRA A C.Microalgae as a raw material for biofuels production[J].J Ind Microbiol Biotechnol，2009，36（2）：269-274.