杜仲法尼烯基焦磷酸合酶基因cDNA全長的克隆與序列分析

杜次 李菁 彭清 湯鵬 田向榮

摘 要：采用RT-PCR法，從杜仲幼嫩葉片中分離法尼烯基焦磷酸基因cDNA全長序列，克隆并對該基因全長序列進行生物信息學分析。從杜仲嫩葉中共獲得兩個基因分別命名為EuFPPs1和EuFPPs2，測序結果表明兩基因開放閱讀框分別為1047bp和1029bp，推測分別可以編碼348個和342個氨基酸殘基，在線預測表明兩個蛋白序列均存在兩個聚丙烯合酶位點。系統進化分析結果表明，EuFPPs1和EuFPPs2分別聚集于不同的分支，它們之間的進化距離為0.352，但是在親緣關系上均與楤木和人參最近，進化距離分別為0.281、0.287，0.175，0.184。關鍵詞：杜仲；FPPs；基因克隆；序列分析：生物信息學中圖分類號：Q71

文獻標識碼：A

文章編號：1007-7847（2015）02-0100-06杜仲是新生代第三紀孑遺植物，是重要的木本藥用樹種，是我國傳統的中藥材[1]，現代醫藥研究表明，杜仲的多種活性成分主要為萜類化合物或萜類相關化合物，如環烯醚萜類的京尼平苷、京尼平苷酸及桃葉珊瑚苷，還有杜仲膠、多糖、氨基酸類、抗真菌蛋白及微量元素等，國內外研究結果表明杜仲有降壓、調節血脂、降血糖、增強免疫力等功效[1-6]。 除了其寶貴的藥用價值外，杜仲更是重要的天然橡膠資源，具有重要價值的杜仲膠也是萜類化合物，杜仲膠是一種反式聚異戊二烯，為順式聚異戊二烯的同分異構，但是理化性質具有很大差異，杜仲膠獨具塑料二重性，是一種新型的天然高分子功能材料，在國防、橡膠工業、醫療和化工等領域具有非常重要的應用價值[5，6]。因此，研究挖掘萜類生物合成途徑相關功能基因對發展杜仲產業具有重要意義。湘西杜仲資源豐富質優，研究湘西地區杜仲膠生物合成途徑相關的功能基因，為以細胞工程為手段的杜仲膠工業化生產以及酶工程研究奠定基礎。1材料與方法1.試劑與材料

試劑：總RNA提取試劑RNAiso Plus、反轉錄酶、Taq聚合酶、DNA marker、載體pMD○R 19-T均購自寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa）；克隆宿主菌體大腸桿菌JM109由上海生工提供，引物均由上海生工合成。實驗材料：采自本實驗室周同的杜仲嫩葉。1.2總RNA提取及cDNA合成剪取杜仲幼嫩枝條，置于裝有干冰的泡沫盒中，立即運回實驗室提取葉片總RNA。快速稱取約100mg杜仲幼嫩葉片，置于液氮預冷的研缽中，倒入少量液氮，迅速研磨成粉，并邊研磨邊添加液氮。采用TaKaRa公司提供的Trizol試劑，并按試劑所提供的策略經過改良提取總RNA[7]。采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質量，并用分光光度汁檢測RNA濃度。利用TaKaRa公司的PrimeScript反轉錄酶試劑盒，試劑盒所提供的方法將所提取的總RNA反轉錄為第一鏈互補鏈DNA（cDNA）。1.3杜仲FPPs基因PCR擴增純化及克隆

從NCBI上搜索FPPs基因序列，根據對高度相似序列的分析設計特異引物，見表1。以cDNA為模板，并以無菌水為模板做陰性對照，按照以下體系對杜仲FPPs基因進行擴增：10×Ex buffer5.0μL，dNTP（2.5mmol/L each）4.0μL，Primer（F）1.0μL，primer（R）1.0μL，Ex Taq 0.25μL，cDNA4.0μL，補加ddH2O至終體積50.0μL；PCR擴增程序如下：94℃預變性5min；30個循環：94℃變性30s。52℃退火30s，72℃延伸1min；72℃延伸10min，4℃保存。利用TaKaRa公司的Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit Vei.2.0對PCR產物進行割膠純化，割膠純化后電泳檢測純化DNA的質量，并用紫外分光光度計檢測其濃度。采用TaKaRa公司提供的載體pMD○R19-T，并按其提供的方法將純化產物連接到載體上，轉化由氯化鈣法制備的JM 109感受太細胞，在氨芐抗性平板上進行藍白篩選，挑取菌落經過PCR檢測后選擇陽性克隆，培養陽性克隆提取質粒送TaKaRa公司測序，測序儀為AB1公司的3730測序儀。1.4杜仲FPPs基因的cDNA序列的信息學分析FPPs基因編碼蛋白的理化性質預測采用ExPASy Proteomics Server提供的在線工具Protparam；FPPs基因可表達的蛋白質結構搜索分別采用在線工具ExPASy PROSITE（http：//www.expasy.ch/prosite/）和NCBI在線工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi/）。蛋白質二級結構分析和結構域的三維建模采用SWISS-MODEL （http：//swissmodel.espasy.org/）。 采用SignalP4.0 Server （http：//www.cbs，dtu.dk/servers/sigalP/）進行分泌蛋白預測[8]；利用WOLF PSORT（http：//wolfpsort.org/）進行蛋白定位信號預測；采用在線軟件HMMTOP（http：//www.enzim.hu/hmmtop/）對蛋白進行跨膜區域預測；通過MEGA5.2構建氨基酸序列系列進化樹[9]。2結果與分析2.1杜仲FPPs基因的克隆和序列分析從NCBI數據庫中，搜索多個高等植物中FPPs基因的cDNA序列，發現存在兩個不同的序列，經過多重比對分析，設計特異引物，以杜仲嫩葉總RNA逆轉錄所獲得的cDNA為模板，利用RT-PCR技術擴增獲得的兩個基因全長序列擴增產物分別命名為Eu FPPs1、Eu FPPs2（如圖1所示），對獲得的兩個基因擴增產物進行測序，所得序列利用Vectoi，NTI軟件分析，發現兩個序列均具有完整開放閱讀框，長度分別為1047 bp、1029 hp。將序列進行BLAST程序檢索，EuFPPs1基因與煙草（Nicotima tabacu.，KJ001141.1）、馬鈴薯（Solanum tuberosum..XM_006352489.1）、番茄（Solanum， lycopersicum.，XM_004248274.1）、青錢柳（Cyclocarya paliurus.，GU121224.1）、大戟（Euphorbiapekinensis.，FJ755465.1）的相似性分別為75%、75%、75%、74%和72%；EuFPPs2與大丁草（Leibnitzia anandria.，JX424568.1）、芒果（Mangifera indica.，JN035296.1）、蒲公英（Taraxacum mongolicum.，JX424566.1）、紫花苜宿 （Medicago saliva.，CU361537.1）的相似性分別為78%、78%、78%和77%。確定EuFPPs1、EuFPPs2均為杜仲FPPs基因cDNA全長序列，CenBank登錄號為KC468-535.1、KC468536.1。2.2EuFPPsl、EuFPPs2基因編碼蛋白序列分析EuFPPsl、EuFPPs2基因經在線翻譯分別可編碼348個和342個氨基酸殘基。利用CLUSTRAL X軟件對原核生物、藻類和高等植物FPPs行序列比對結果表明，植物FPPS具有與其他生物一樣的5個保守結構域[10]，即：結構域I （GKXXR）；結構域II（EXXXXXXLXXDDXXDXXXXRRG）；結構域III（CQXXD）；結構域IV（KT）；結構域IV（GXXFQXXDDXXDXXXXXXXXCKXXX DXXXXK），除原核生物中的結構域IV（KT）不同，其他結構域均具有很高的保守性，如圖2，其中富含天冬氨酸的聚丙烯合酶基序[11-15]（LVIDDim..DSshtRRG， MGsyFQVqDDYID），該保守序列在酶的活性催化和底物結合中其重要的功能作用。2.3Eu FPPsl、EuFPPs2基因編碼蛋白的理化性質根據ExPASy ProteomICs Server、提供的在線工具Protparam對EuFPPsl、EuFPPs2基因編碼的蛋白的理化性質進行預測分析，EuFPPs1、EuFPPs2基因編碼的蛋白理化性質如表2。2.4EuFPPsl、EuFPPs2二級結構及三級結構預測

分別對杜仲中的EuFPPs1、EuFPPs2基因編碼蛋白的二級結構進行預測，結果表明蛋白EuFPPs1主要由α-螺旋結構構成，占67.7%；β-折疊占7.96%，其他結構占24.340%；EuFPPs2也主要由α-螺旋結構構成，占69.6%；β-折疊占9.28%，其他結構占21.12%。

通過Prosite在線數據庫分析EuFPPs1、EuFPPs2蛋白的結構位點，發現EuFPPs1蛋白序列含有5類功能位點，4個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點，2個豆蔻酰化位點，6個蛋白激酶C磷酸化位點，1個氨酰化位點，1個N-端糖基化位點；EuFPPs2蛋白序列含有4類功能位點，分別是1個豆蔻酰化位點，4個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點，3個蛋白激酶C磷酸化位點，1個酪氨酸激酶磷酸化位點。由SWISS-MODEL Workspace在線軟件建立的EuFPPsl和EuFPPs2蛋白的三維結構模型，如圖3。2.5信號肽及亞細胞定位及跨膜區域預測使用在線軟件SignalP4.0 Server對EuFPPs1和EuFPPs2進行預測分析發現，EuFPPs1和EuFPPs2都是非分泌蛋白；WOLFPSORT在線預測表明EuFPPs1最可能定位于細胞質小（cytoplasm：10.0， nucleus： 3.0），EuFPPs2最有可能定位于細胞質中（cytoplasm： 10.0， nucleus： 2.0， mitochondria：1.0）。經過在線軟件HMMTOP對EuFPPs1和EuFPPs2基因可編碼的蛋白序列進行跨膜預測發現EuFPPs1、FuFPPs2均無跨膜區域。2.6不同物種EuFPPs1、EuFPPs2氨基酸序列比對及進化分析從NCBI的非冗余蛋白數據庫（Nr）中選取與EuFPPs1和EuFPPs2基因編碼蛋白相似性較高的34條FPPs蛋白序列。采用軟件MEGA5.2構建ML系統進化樹，如圖4所示。高等植物、藻類和原核生物來源的FPPs蛋白序列在進化上分別屬于不同的分類群。EuFPPs1和EuFPPs2分別聚集于不同的分支，但是在親緣關系上均與楤木和人參最近，其中EuFPPs1與楤木和人參的進化距離分別為0.281和0.287，EuFPPs2與楤木和人參分別為0.175和0.184。3 討論

法尼烯基焦磷酸合酶（ FPPs）是異戊二烯途徑中的重要調節酶，在植物體內催化異戊烯基焦磷酸和牻牛兒基焦磷酸生成法尼烯基焦磷酸（FPP），是各種倍半萜化合物如脫落酸和杜松烯等的合成前體[16、17]。法尼烯基焦磷酸可經過牻葉兒基牻牛兒基焦磷酸合酶（GGPPs）合成聚異戊二烯的前體牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（GGPP），同時FPP也可直接作為前體生成聚異戊二烯。因此，FPPs在植物多種生物活性物質，尤其是橡膠膠等重要的工業原料的合成中具有重要的作用。

生物信息學分析是預測基因功能的有效手段[18]。到目前為止，植物FPPS基因已分別從橡膠[19]、煙草[20]、高粱[21]、水稻[22]、刺五加[23]、丹參等40多種植物中分離克隆出來，經過測序分析，植物FPPSmRNA長度范圍為1040～1731bp，外放閱讀框長度范同為924～1224 bp，可編碼由307～407個氨基酸組成的多肽。

成功克隆了杜仲中的兩個法尼烯基焦磷酸合成酶基因（EuFPPs1和EuFPPs2），并對其全長cDNA序列進行測序和生物信息學分析，推測杜仲EuFPPsl和EuFPPs2基因分別可編碼348個和342個氨基酸殘基，相對分子質量為40.04kD和39.55kD，與已研究報道的大多數FPPs大小相同或相近。WOLFPSORT預測結果表明EuFPPs1和EuFPPs2最可能定位在細胞質中，均含有兩個聚丙烯合酶基序。FPP合成酶是一種細胞質二聚酶，而且無論原核生物還是真核生物，其FPPs均含有聚丙烯合酶基序，具有高度的保守性，在植物萜類化合物的生物合成中發揮重要的功能[9-13]。因此，本研究從杜仲中克隆的兩個EuFPPs均屬于FPPs基因家族，在杜仲的萜類化合物及杜仲膠的合成中發揮重要作用。

EuFPPsl和EuFPPs2相差6個氨基酸殘基，它們之間的相似性為72.4%，系統發育分析表明EuFPPs1與EuFPPs2聚集在同一類群不同分支，兩者間的進化距離為0.352，而且在親緣關系上均與楤木和人參最近，其進化距離分為0.281、0.287；0.175、0.184。據杜仲EuFPPs1和EuFPPs2間的序列差異，推測兩者可能存在功能上的差異，可能分別調控不同的分支代謝途徑，因此，EuFPPs1和EuFPPs2在杜仲中的代謝差異和分子機制有待進一步的研究。[1]杜紅巖.杜仲活性成分與藥理研究的新進展[J].經濟林研究 （DU Hong-yan. The progress in research of the active compo?nent from Eucommia ulmoides and its Pharmacologyf[J]. Economic Forest Researches），2003，21（2）： 58-61.[2]KWAN C Y， CHEN C X， DEYAMA T， el d. Endothel iumdependent vasorelaxant effects of the aqueous extracts of the Eucommia ulmoides Oliv. Leaf and bark： implication on their antihyperlensive action[J]. Vascular Pharmacol，2004，11（24）：229-235.[3] LEE G W， YON H C， BYUN S Y. Inhibitory effect of Eucommia ulmoides Oliver on adipogenic differentiation through promeanalysis[J]. Enzyme and Microbial Technology，2004，（6）： 52-638.[4]OK AD A N， SHIATA K， NIWANO M， et al. Immunosuppressive activity of a monoterpene from Eucommia ulmoides[J]. 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