大葉楊組培快繁體系的建立

彭言劼　李明勇　趙亞津　龐旭鳳　宋春草　熊瑞婷　杜克兵

摘 要： 以大葉楊幼嫩的帶腋芽莖段為試材，建立以腋芽誘導途徑為基礎的植株組培快繁體系。結果表明：大葉楊腋芽誘導的最適宜培養基為MS+NAA0.1 mg/L+6BA0.1 mg/L，接種30 d，腋芽萌發率可達100%；最適宜增殖培養基為MS+NAA0.1 mg/L+6BA2.0 mg/L，培養30 d，增殖系數可達4.0，幼苗生長健壯；最佳生根培養基為1/2MS+NAA0.1 mg/L+IBA0.2 mg/L，培養30 d，平均生根達4條，平均根長為4.7 cm。

關鍵詞： 大葉楊；組織培養；腋芽誘導；快繁體系

中圖分類號：S722.3+7；Q813.1+2 文獻標識碼：A 文章編號：1004-3020（2015）02-0013-04

大葉楊Populus lasiocarpa 屬于楊柳科Salicacae楊屬大葉楊派Leucoides的一種植物，是楊屬植物中最古老最原始的樹種之一，為中國特有的鄉土樹種，原產于華中地區，僅在湖北、陜西、四川、貴州和云南省有野生種分布，國外無野生種群分布[1-2]。大葉楊適宜海拔600～2 800 m的山地，具有較高的生態價值，其高山地區的適生性是山地楊樹育種的優良基因資源。但是，迄今大葉楊仍處于野生狀態，未得到有效保護與利用。因此，開展大葉楊種質資源的保存與利用研究具有重要意義。

已有研究顯示，大葉楊扦插成活率極低，不同生根劑處理的枝插成活率均為零，根插成活率亦低于15%。嫁接成活率相對較高，但對砧木要求特殊，目前僅發現山地楊與其具有較高的親和性[3]。這些都對大葉楊種質資源的保存造成一定困難。組織培養是快速高效繁殖、保存種質資源的重要方法。然而，目前大葉楊尚無這方面的報道。本研究以湖北省大葉楊優良單株為試材，開展組織培養研究，建立高效組培快繁體系，以期為我國大葉楊優良種質資源的保存和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

從湖北省宜昌市樟村坪林場，東經111°4′～111°13′，北緯31°11′～31°18′，平均海拔1 100 m選擇大葉楊優良單株，截取健壯的休眠枝條，帶回實驗室水培催芽。

1.2 無菌材料的獲得

將帶腋芽的莖段置于飽和的洗衣粉溶液中浸泡10 min，取出洗凈后用流水沖洗1.5 h，并用蒸餾水潤洗3遍，再于超凈工作臺中消毒。消毒方法為：先用70%的酒精浸泡30 s，隨后用無菌蒸餾水沖洗2遍，再用0.1%升汞溶液浸泡5 min（期間不斷晃動），接著用無菌蒸餾水沖洗6次，所獲得的材料即為無菌的外植體。將帶腋芽的莖段切成長1.5 cm左右的小段（帶1個腋芽），接種于腋芽誘導培養基中，進行腋芽誘導培養。

1.3 腋芽誘導

基本培養基選擇楊樹組織培養中最常用的MS培養基（pH=5.8）[4]，選用6BA 4個濃度水平（0.1，0.5，1.0，2.0 mg/L）和NAA 2個濃度水平（0.1，0.5 mg/L），以及不含任何激素的MS培養基，共設計9種處理（表1），每處理4次重復，每重復接種4個外植體。在對黑楊派楊樹組培的研究中發現，雖然BA與NAA的比值高有利于芽的誘導，但無NAA的培養基誘芽效果不及含有少量NAA的培養基[5]，故本試驗中均不設單一激素處理。培養條件為光照強度為1 500～2 000 lx，溫度（25±2）℃，光照時間16 h/d。接種10 d后統計污染率與褐化率，30 d后統計腋芽萌發率。其中，污染率（%）=污染的莖段數/接種的總莖段數×100%；褐化率（%）=褐化的莖段數/接種的總莖段數×100%；腋芽萌發率（%）=腋芽萌發的莖段數/接種的莖段數×100%。

1.4 增殖培養

將誘導萌發的腋芽切下，接種于增殖培養基中進行增殖培養。以MS作為基本培養基，選用6BA 3個濃度水平（0.5，1.0，2.0 mg/L）和NAA 3個濃度水平（0.05，0.1，0.25 mg/L），共9個處理（表2），采用完全隨機試驗設計，每處理5次重復，每重復接種3～4個腋芽，30 d后統計增殖系數及生長情況。其中，增殖系數=30 d有效芽數/接種芽數。

1.5 生根培養

將增殖培養后高約2.0 cm的幼苗切下，接種于生根培養基中進行生根培養。采用1/2MS培養基為基本培養基，激素選用NAA 2個濃度水平（0.1，0.2 mg/L）和IBA 3個濃度水平（0.1，0.2，0.4 mg/L），共6種處理（表3），每處理3次重復，每重復接種4棵苗。30 d后統計生根數量及根長。

1.6 數據分析

試驗中的所有數據采用Excel2003軟件進行處理，用SAS9.0進行方差分析和多重比較。

2 結果與分析

2.1 不同激素配比對大葉楊腋芽誘導的影響

接種10 d后，腋芽誘導培養的莖段污染率為3.81%，褐化率為3.47%。外植體接種后，約7 d腋芽明顯膨大，12 d后腋芽開始萌發，部分外植體基部膨大形成黃綠色愈傷組織（圖1A）。30 d 時統計結果顯示，外植體腋芽萌發率最低的培養基為IC1，僅為31.3%。6種培養基（IC2～IC4、IC6、IC8、IC9）的腋芽誘導率達到了75%以上，且相互之間差異不顯著（P>0.05）。其中，IC2的腋芽萌發率最高，達到100%，且莖段生長正常，葉片鮮綠（表1，圖1A）。方差分析顯示，6BA及其與NAA的交互作用對腋芽誘導的影響達到極顯著水平（P<0.01），而NAA的影響不顯著（P>0.05）。隨著6BA濃度的升高，萌發的腋芽莖段幾乎不伸長，呈叢生狀。綜合萌發率與腋芽生長性狀，選擇IC2（NAA 0.1 mg/L + 6BA 0.1 mg/L）為大葉楊腋芽誘導的最適培養基。

2.2 增殖培養

增殖培養過程中，幼苗在葉柄處產生腋芽，同時在基部切口處分化出不定芽（圖1B），或者基部膨大形成愈傷組織，再從愈傷組織分化不定芽（圖1C）。9種培養基對增殖效果的影響極顯著（P<0.01）。方差分析顯示，NAA、6BA對增殖效果的影響皆達到極顯著水平（P<0.01），兩者的的交互作用對增殖效果的影響也達到顯著水平（P<0.05）。在NAA濃度不變的情況下，隨著6BA濃度的增加，增殖系數呈上升趨勢。6BA/NAA濃度的比值在20以上的3種培養基（PM2，PM3，PM6）的增殖系數顯著高于其他組合（P<0.05）。兩者的比值達到40時（PM3），導致幼芽長勢弱，節間生長不明顯，芽成簇狀芽。9種培養基中，PM6的增殖系數最高，達到4.0，且芽苗生長健壯（圖1C），故認為PM6（NAA 0.1 mg/L + 6BA2.0 mg/L）為大葉楊的最適增殖培養基。

2.3 生根培養

培養7 d后，幼苗逐漸從基部生出不定根，30 d時6種培養基中，幼苗生根率皆為100%（表3）（圖1D）。當IBA濃度相同時，0.1mg/L的NAA（R1，R3，R5）對生根的促進作用顯著大于0.2 mg/L的NAA（P<0.05）。生根效果最好的是R3和R5，兩者間差異不顯著（P>0.05）。R5的生根條數最多（4.7根），平均根長也最長（5.27 cm）（表3），但基部膨大形成愈傷組織，煉苗時易造成根系折斷。R3的生根條數為4條，平均長度為4.7 cm（表3），且根系分支發達（圖1D），幼苗生長健壯。因此，選擇R3（NAA0.1 mg/L+IBA0.2 mg/L）培養基為大葉楊最適生根培養基。

3 討論

利用組織培養進行種質資源離體保存，不僅能在短時間內獲得大量的無性系，而且有占據空間小，節約土地資源和降低保存成本等優勢[6]。目前，已有許多物種利用組培進行種質資源離體保存的報道，例如葡萄[7]、柑桔[8]等，也有大量楊樹組織培養快繁的報道，如箭桿楊[6]、鉆天楊[9]、山新楊[10]等。本研究以大葉楊腋芽誘導途徑建立了較高效的組培快繁體系，實現了大葉楊利用組培方法進行種質資源的離體保存。

NAA已被報道普遍使用于楊樹及其他植物的組織培養中，對培養結果影響顯著，而大葉楊腋芽誘導的方差分析結果表明，NAA對誘芽效果的影響不顯著（p>0.05），試分析原因可能是本研究中NAA濃度取值范圍太小，NAA的誘芽效果在此范圍內差異不顯著，亦可能是大葉楊對NAA不敏感。后者與全永壽等[3]用不同生根劑處理大葉楊枝條進行扦插無成活的情況相符。

除了激素的種類和濃度對植物產生的影響外，激素間的不同配比對組培效果的影響也很重要。于志水等[5]在黑楊派楊樹的組培體系研究中發現，6BA和NAA的比值對芽誘導具有調控作用，比值越大越有利于芽誘導。本研究增殖培養中觀察到的相似的情況。高比值（20以上）的組合對芽的誘導有明顯的促進作用，在比值相同，激素濃度不同時也有相似的效果（PM2與PM6）（表2）。但是，過高濃度的6BA（PM3）會造成芽苗長勢弱，基部葉片大，節間生長不明顯，形成簇狀芽。這種叢生芽不僅在繼代操作中不易切割開，而且在后來的培養中易畸形或玻璃化[11，12]。

生根是組織培養中的一個關鍵環節，生根是否成功可以決定能否得到一棵完整的植株。而大葉楊扦插繁殖幾乎不能成活，原因可能是不易生根。本研究采用了兩個促進生根的措施解決了這個問題，一是使用無機元素減半的1/2MS作為基本培養基促進側根的發育[13]；二是采用IBA與NAA兩種促進生根的激素組合。付成華[14]在對常綠楊生根培養時發現，過高濃度的IBA會使根系纖細，毛狀根少，基部產生膨大的愈傷。本研究中在IBA濃度達到0.4 mg/L（R5）時，植株基部膨大，根系細，分支少，而在0.2 mg/L的IBA（R3）中生長的植株根系粗壯，分支發達（圖1D）。

參 考 文 獻

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（責任編輯：鄭京津）