甜瓜自毒作用相關MYB轉錄因子的克隆和表達分析

奚玉培　張志忠　謝新蕊　高強

摘 要 根據甜瓜自毒作用相關MYB轉錄因子核心區序列設計引物，采用RACE技術獲得MYB cDNA全長。生物信息學分析表明，該轉錄因子全長1 164 bp，包括174 bp的5′非翻譯區，105 bp的3′非翻譯區，885 bp的開放閱讀框，編碼 294個氨基酸，屬于MYB類轉錄因子中R2R3-MYB類型，與黃瓜R2R3-MYB類轉錄因子的氨基酸序列的同源性達97.28%。實時熒光定量PCR結果表明，該基因在植株浸提液脅迫處理2 d時表達量最高，推測該轉錄因子可能參與了甜瓜自毒相關基因初期的誘導表達，使植株對自毒脅迫做出主動的系統性應答反應。

關鍵詞 甜瓜；自毒作用；MYB轉錄因子；植株浸提液

中圖分類號 S652 文獻標識碼 A

甜瓜（Cucumis melo L.）為葫蘆科黃瓜屬植物，世界范圍內廣泛栽培，經濟價值較高，也是目前我國主要栽培瓜類之一。瓜類作物普遍不耐連作，加之近年來由于耕地面積持續減少、設施栽培迅速發展，輪作和間作在甜瓜栽培中愈加困難，連作障礙問題日益突出。連作障礙的一個重要表現為植物根際土質惡化、有害微生物增多，植物自毒作用是導致這一問題的重要原因，即這一變化主要是由于植物殘茬和根系分泌物在土壤中的不斷累積所致。甜瓜自毒作用的相關研究較少，多以形態學觀察為主，難以深入說明問題，近年來相關的分子生物學研究表明這一過程涉及的基因差異表達情況較為復雜，與信號傳導、能量代謝、物質合成和運輸、逆境應對和轉錄調控等均有關系，在對轉錄因子的分析中發現MYB表現出明顯的差異性表達，和甜瓜自毒作用關系密切[1-2]。

自毒作用實質上是一種脅迫，植物在脅迫條件下轉錄水平上的調控往往是由啟動子和與之相互作用的轉錄因子共同完成的，MYB轉錄因子是高等植物中數量最多的一類轉錄因子，作用廣泛，在植物對激素和環境因子應答、次生代謝、細胞分化和器官形態建成等過程中均起著重要作用[3-12]，如研究表明擬南芥MYB 參與了干旱、鹽脅迫、低溫脅迫的抗性[13]；在高溫、干旱、鹽和脫落酸脅迫的誘導下，番茄中R2R3-MYB類轉錄因子的表達量發生明顯變化[14]。迄今已發現并克隆了多種植物的MYB轉錄因子，以含有保守的MYB結構域為共同特征，分為3個亞族（R1/2-MYB、R2R3-MYB和 R1R2R3-MYB）。目前尚未見關于甜瓜MYB轉錄因子的報道，本實驗室前期研究結果表明，高濃度（≥0.03 g/mL）的甜瓜植株浸提液對甜瓜幼苗的形態特征和生理生化指標均產生不同程度的影響；cDNA-AFLP（cDNA amplified fragment length polymorphism）技術分析此濃度植株浸提液脅迫下甜瓜基因的差異表達，得到了MYB轉錄因子的TDF片段[15-16]。本研究擬對甜瓜自毒作用相關MYB轉錄因子進行克隆，并通過熒光定量PCR分析其在甜瓜自毒作用中的表達情況，為解釋甜瓜自毒作用的分子機理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 甜瓜品種：“新銀輝”，購于福建省農嘉種業股份有限公司。

1.1.2 菌株和試劑 多糖多酚植物總RNA提取試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司；RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒購自Fermentas公司；SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit試劑盒購自Clontech公司；pMD-18T Vector、PrimeScript RT Reagent Kit（Perfect Real Time）試劑盒、SYBRR Premix Ex Taq TM （Tli R NaseH Plus）均購自大連寶生物公司；大腸桿菌DH5ɑ為本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 植株浸提液的獲取 選取新鮮健康甜瓜植株，用蒸餾水沖洗干凈，100 ℃殺青25 min，然后60 ℃烘干至恒重，研磨成粉，混合均勻后稱取15 g，加500 mL無菌ddH2O，密封震蕩（90 r/min）室溫下浸提2 d，依次用紗布、濾紙和0.2 μm孔徑47 mm直徑的微孔濾膜過濾，無菌dd H2O定容，即得濃度為0.03 g/mL的浸提液。前期研究顯示此濃度處理對甜瓜植株有明顯的自毒效應，且不足以致死。

1.2.2 植物材料的處理 甜瓜健康植株長到三葉一心時進行處理，在無土栽培基質（珍珠巖、蛭石、泥炭體積比為3 ∶ 1 ∶ 1）中添加10 mL濃度為0.03 g/mL植株浸提液進行脅迫處理，以無菌蒸餾水為對照。分別于處理1、2、3、4 d后采集甜瓜的根、莖和第3～4葉位的葉片，放入液氮速凍后置于-80 ℃冰箱中保存，用于提取RNA。

1.2.3 總RNA提取和cDNA合成 利用植物多糖多酚提取試劑盒（百泰克）分別提取甜瓜葉片、莖和根的總RNA，并檢測其純度和完整性，參照試劑盒說明書（Fermentas），取1 μg RNA反轉錄cDNA。

1.2.4 MYB轉錄因子的克隆和分析 根據前期研究獲得的MYB核心區序列[1]，設計3′和5′引物（表1）。PCR反應程序為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，49～54 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個循環；72 ℃ 10 min。3′ RACE和 5′ RACE分別使用2輪巢式引物進行擴增，第1輪產物稀釋10倍作為第2輪模板，第2輪PCR產物經電泳檢測后回收目的片段。回收產物純化后連入載體pMD18-T，轉化大腸桿菌DH5α，對獲得的陽性克隆進行測序，利用DNAMAN拼接MYB cDNA全長，據此設計ORF引物，PCR擴增獲得全長。利用ProtParam程序預測該序列編碼產物的分子量、理論等電點以及蛋白質疏水性等信息；通過 TMpred Server軟件進行氨基酸序列跨膜分析；通過NCBI在線軟件搜索同源序列，利用DNAMAN軟件進行相關氨基酸序列的同源性分析；用MEGA5.2構建系統進化樹，并與其他植物的MYB轉錄因子進行比對分析。

1.2.5 MYB轉錄因子的實時熒光定量PCR分析

分別以0、1、2、3、4 d脅迫處理的甜瓜葉片總RNA為模板，采用PrimeScript RT Reagent Kit（Perfect Real Time）試劑盒合成cDNA第一鏈。根據SYBRR Premix Ex Taq TM（Tli R NaseH Plus）使用說明書，用羅氏 LightCycler 480熒光定量PCR儀對MYB轉錄因子在處理的不同階段表達量進行分析。反應程序：94 ℃ 10 s，94 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，40個循環。實驗設3次重復。以甜瓜Actin作為內參基因校正和標準化目的基因。

2 結果與分析

2.1 甜瓜MYB轉錄因子的克隆和生物信息學分析

PCR擴增獲得長1 164 bp的cDNA 序列（圖1），包含一個885 bp的完整閱讀框，編碼294個氨基酸，包括174 bp的5′非翻譯區，105 bp的3′非翻譯區（圖2）。預測蛋白質分子量為32.2 ku，理論等電點為9.42。該基因編碼較多的氨基酸為絲氨酸、脯氨酸、甘氨酸、亮氨酸等。帶負電的氨基酸（Asp+Glu）29個，帶正電的氨基酸（Arg+Lys）35個，脂肪系數64.69，總平均疏水性（GRAVY）值為-0.713。Blast結果顯示實驗中獲得的甜瓜MYB轉錄因子屬于R2R3-MYB 類型。

通過NCBI在線軟件找到8條同源性較高的R2R3-MYB類轉錄因子序列，對這些轉錄因子和甜瓜R2R3-MYB類轉錄因子編碼的氨基酸序列進行同源性分析，結果如圖3所示。該基因與不同植物（甜橙、梅花、麻瘋樹、蓖麻、黃瓜、淫羊藿、花生和苜蓿）R2R3-MYB類轉錄因子編碼的氨基酸序列同源性為48%～98%，表明R2R3-MYB類轉錄因子類型的多樣性，但不同植物間R2R3-MYB類轉錄因子結構域高度保守。其中與黃瓜（XP_004142878.1）的同源性達97.28%。

甜瓜R2R3-MYB類轉錄因子與部分已知植物R2R3-MYB 類轉錄因子編碼的氨基酸序列構建的系統發育樹如圖4。甜瓜R2R3-MYB類轉錄因子同黃瓜MYB44-like 轉錄因子（XP_004142878.1）基因聚類關系最近；麻瘋樹（AFV73403.1）與蓖麻（XP_002510155.1）同為大戟科，聚為一類；花生（AHB59592.1）與苜蓿（XP_003611666.1）同屬蕓香科，聚為一類；甜橙（NP_001275798.1）與梅花（XP_008220277.1）為不同科，但聚為一類；小檗科的淫羊藿單獨成類。

2.2 甜瓜MYB轉錄因子在不同處理時期表達量的分析

在植株浸提液介導的自毒作用過程中，甜瓜葉片、莖和根中該MYB轉錄因子表達量變化的熒光定量PCR檢測結果如圖5。植株浸提液處理2 d時，根和葉部位R2R3-MYB轉錄因子的表達量變化最明顯，分別是對照的35.37倍和13.41倍，隨后逐漸降低；而在莖部其相對表達量變化不明顯。說明R2R3-MYB轉錄因子在自毒誘導初期表達量迅速增加，此后逐步降低，該轉錄因子可能參與了甜瓜自毒相關基因初期的誘導表達，進而使植株對自毒脅迫做出主動的系統性應答反應。

3 討論與結論

本研究獲得的甜瓜自毒作用相關MYB轉錄因子為R2R3-MYB類，此類是目前植物中研究數目最多的一類MYB[17]，如在擬南芥中已經發現126個R2R3-MYB成員[18]，該家族基因特點是在N-端含有由2個MYB結構域構成的DNA結合功能域，而在C-端絕大多數都具有轉錄激活功能域。Kranz等[19]根據植物R2R3-MYB的C-端氨基酸序列將其進一步細分為22個亞組，在植物次生代謝、細胞形態發生、激素刺激和環境脅迫應答、分生組織形成及細胞周期控制等多個環節中均起關鍵性作用[20-25]。

轉錄水平上調控相應基因的表達是植物對逆境脅迫最初的反應，此類調控往往是由啟動子和對應轉錄因子共同完成的。 研究結果證明，紫外輻射、高鹽、干旱等逆境脅迫可提高大豆GmMYBJ6在自身體內的表達水平[24]；干旱誘導脅迫處理下，擬南芥Atmyb2可使耐鹽基因rd22 表達上調[26]。本實驗結果表明在自毒脅迫初期（2 d）時，甜瓜R2R3-MYB轉錄因子的表達量最高，此后逐漸降低，該轉錄因子可能參與和調控了相關基因的誘導表達，最終形成植株在生理、生化和形態等水平上應激反應，降低或消除脅迫傷害。了解MYB轉錄因子的作用機理對于揭示甜瓜自毒脅迫應答基因的表達調控有重要意義。

研究表明大豆中GmMYBJ6基因可提高類黃酮代謝途徑中的苯丙氨酸氨基裂解酶（PAL）、肉桂酸-4-羥化酶（C4H）、4-香豆酰輔酶A連接酶（4CL）、查爾酮合成酶（CHS）、黃酮醇合成酶（FLS）等關鍵酶的表達[24]；金魚草中AmMYB305與AmMYB340共同調控苯丙烷代謝途徑第一個酶PAL的合成[27]，而苯丙烷代謝途徑中的多個中間產物和瓜類化感作用密切相關。本實驗室前期研究表明此代謝過程中間產物肉桂酸、香豆酸、查爾酮和柚皮苷等物質均為甜瓜重要的化感自毒物質[15]，這從一個側面證實了本實驗獲得的MYB轉錄因子和甜瓜化感自毒作用密切相關。甜瓜MYB轉錄因子可能通過影響苯丙烷代謝途徑中多個相關酶的合成，進而對化感自毒物質的產生和累積起到一定的調控作用。

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