稻瘟病菌MGG14093基因功能的初步研究

吳麗民　卞文印　胡芳輝　連永樂　聶雅婷　王宗華　魯國東

摘 要 根據之前的基因芯片分析，發現在稻瘟病菌侵染水稻的過程中，許多基因被誘導表達。MGG14093為其中一個推測為編碼分泌蛋白的未知功能基因，在病菌侵染過程中該基因表達量上調2.906。利用生物信息學在線軟件對該基因編碼蛋白的特性進行初步分析，并通過RT-PCR擴增進一步分析該基因在稻瘟病菌侵染水稻過程中的表達動態，利用基因敲除和過量表達技術對該基因的功能進行初步研究。結果表明：該基因編碼蛋白為定位于胞外的分泌蛋白，沒有已知的蛋白結構域，但可能存在幾處氨基酸活性位點。MGG14093基因敲除和過量表達后，對稻瘟病菌的營養生長、產孢及附著胞分化沒有顯著的影響，但該基因過量表達后導致病菌的致病力下降，表明該基因可能參與病菌的致病過程。本研究結果為進一步揭示MGG14093基因的生物學功能奠定了基礎。

關鍵詞 稻瘟病菌；MGG14093基因；致病性

中圖分類號 S435.11 文獻標識碼 A

稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起的稻瘟病是水稻最重要的病害之一[1]。在流行季節，稻瘟病可對全世界大約85個水稻生產國家，造成70%～80%的糧食生產損失[2]。據報道，每年因稻瘟病造成損失的糧食足夠養活60億的人口[3]。在中國，2001年和2005年稻瘟病的流行導致了570萬hm2的糧食絕收[4]。稻瘟病菌是一種致病的子囊真菌，是真菌病害分子機制研究的模式生物。對稻瘟病菌基因功能的研究，有助于揭示該菌致病的分子機理，也為稻瘟病防治策略的開發提供新的思路，因此，本研究具有重要的理論意義和潛在的應用價值。

稻瘟病菌的侵染是通過其特殊的結構-附著孢形成的侵入栓侵入到寄主組織內部。近年來的研究報道表明，附著孢介導的侵入過程受到幾個高度保守的信號網絡的控制，如G蛋白偶聯受體GPCRS、自噬、促分裂素原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinases，MAPK）、環腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）及Ca2+調信號等，這些信號系統均受到基因的調控[5-6]。相關基因的缺失可影響稻瘟病菌的生長速度、交配和分生孢子的產生等。此外，稻瘟病菌的侵染還受到其它許多基因的調控，如MAGB、ACR、MgWC-1、CON7等[1]。在對病原菌與寄主互作的研究過程中，效應子的研究也成為了熱點。目前陸續報道的細菌效應子有PthA、PthXo1、PthXo6、AvrPto、Avrxa23、AvrBs3等[7-8]；真菌效應子的報道也有很多，如稻瘟病菌的效應蛋白Pwl1、Pw12、ACE1、Avr1CO-39、AvrPi-ta、AvrPiz-t、Avr-Pi、AvrPii、Avr-Pik等[9-10]，這些研究為進一步揭示病原菌的致病機理奠定了良好基礎。通過稻瘟病菌全基因組基因芯片的分析，發現了許多在病菌侵染過程中差異表達的基因，本研究著重研究上調表達的MGG14093（log值為2.906）基因，并進行缺失和過量表達分析，初步明確該基因的功能。

1 材料與方法

1.1 材料

稻瘟病菌（M. oryzae）菌株Guy11、△Ku80及水稻品種CO39保存于作者所在實驗室。

1.2 方法

1.2.1 序列的獲得與分析 在稻瘟病菌基因組數據庫（http：//www.broadinstitute.org/annotation/genome/

magnaporthe_grisea/MultiHome.html）中，查找獲得MGG14093的氨基酸序列及對應的核苷酸序列；使用BLASTP搜索工具，在NCBI數據庫中搜索其同源蛋白序列；利用SignalP 4.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）工具，對MGG14093蛋白序列進行信號肽分析；利用ProtComp v. 9.0（http：//www.softberry.com/）在線工具進行蛋白的亞細胞定位分析；利用生物在線工具ExPASy（http：//prosite.expasy.org/）對MGG_14093蛋白質可能存在的活性位點進行預測。

1.2.2 基因各階段表達的驗證 提取稻瘟病菌野生型菌株Guy11的菌絲及其侵染水稻后48、72、96 h的水稻RNA；以14093 OF和14093 OR為引物，采用半定量RT-PCR方法，擴增MGG14093基因的ORF（閱讀框）序列；在稻瘟病菌野生型菌株Guy11在菌絲生長過程中和侵染水稻親和品種CO39 48、72、96 h后，檢測MGG14093基因的表達量，并分析該基因在不同時段的表達動態。PCR擴增[11]的熱循環條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s ，循環31次；72 ℃延伸10 min。

1.2.3 基因敲除突變體的獲得 以稻瘟病菌菌株Guy11的基因組DNA為模板，采用引物14093AF和14093AR擴增稻瘟病菌MGG14093開放閱讀框（ORF）上游1 005 bp的A片段，并克隆到pCX62載體14093-A的XhoⅠ和EcoRⅠ酶切位點之間；同理，采用引物14093BF和14093BR，擴增該基因開放閱讀框（ORF）下游878 bp的B片段，并克隆到pCX62載體BamHⅠ和SpeⅠ酶切位點之間，最后獲得基因敲除載體pCX62-14093-AB；以稀釋后的基因敲除載體pCX62-14093-AB為模板，采用引物14093AF和14093BR擴增A-hph-B片段所得的適量A-hph-B片段PCR產物，在PEG介導下，轉化到新鮮制備好的△ku80的原生質體，通過同源重組的方法進行基因敲除[11]。利用PCR方法篩選基因敲除的陽性轉化子，用1593OF和15293OR擴增突變體野生型菌株的239 bp的ORF，用A片段上游71 bp擴增UAH的前引物14093UA和潮霉素內部H853的后引物擴增1 450 bp的UAH片段。上述PCR擴增的體系及反應條件參照1.2.2，退火溫度見表1。

1.2.4 基因過量表達載體的構建和突變體的獲得 過量表達載體的構建：利用pET11上的xhoⅠ和speⅠ的2個酶切位點，設計引物14093OEF和14093OER擴增MGG_14093編碼閱讀框序列，載體和PCR產物分別酶切，連接到pET11載體上；在PEG介導下，將構建好的14093PTE11過量表達載體轉化到新制備好的△ku80原生質體上，用潮霉素篩選過表達轉化子，用RT-PCR驗證過量表達突變體。

1.2.5 MGG14093突變體表型分析 （1）生長速度測定：取濾紙片保存的菌株在淀粉酵母瓊脂培養基上活化，生長3～4 d后，在菌落的外緣用直徑0.5 cm的打孔器打孔，將圓形的菌絲塊倒放在新的淀粉酵母瓊脂培養基平板上，在28 ℃溫度下倒置培養；在生長的第3、5、7、9天分別測量菌落的直徑，到第10天時，進行拍照。

（2）產孢量分析：用Wu等[11]的方法收集基因敲除突變體、異位整合突變體、過量表達突變體及野生型菌株突變體的分生孢子并計數。用米糠培養基產孢，孢子以1～5×104個/mL濃度20 μL/滴，滴在疏水膜上，28 ℃保濕暗培養，每2 h觀察孢子的萌發、附著孢的產生并計數。

（3）致病性鑒定：水稻親和品種（品種CO39）培養15 d左右，將稻瘟病菌各菌株濃度為1×105～2×105個/mL的孢子懸浮液噴霧接種于水稻葉片上，黑暗無光照條件下，保濕24 h后，28 ℃連續保濕、光照6 d， 在第7天調查病情[11]，將感病葉片掃描并存檔。

以上每個實驗均做3次重復。

1.3 數據分析

數據的ANOVA差異著性分析采用Excel軟件。

2 結果與分析

2.1 MGG14093.6的生物信息學分析

稻瘟病菌基因組數據庫中，MGG14093基因的大小為572 nt，編碼1個168 aa未知功能的蛋白（predicted protein）。利用Blastp尋找同源相似蛋白，結果發現能夠匹配到的已知蛋白序列中，氨基酸的同源性很低；SignalP分析結果顯示，該蛋白中信號肽預測值是0.951；采用ProtComp v. 9.0軟件定位分析，結果發現該蛋白定位于胞外；采用ProtParam軟件分析該蛋白的氨基酸數目、分子量和理論等電點，結果發現該蛋白屬于不穩定蛋白（表2）。

在線工具ExPASy預測結果發現，MGG14093蛋白質可能存在幾處氨基酸活性位點，如環腺苷酸磷酸化位點、乙酰化位點、酪氨酸激酶2磷酸化位點、蛋白激酶C磷酸化位點等。這些可能存在的磷酸化或者乙酰化位點對于蛋白質功能的發揮可能起著重要的作用。

2.2 MGG14093基因的表達動態

半定量RT-PCR結果見圖1，與參照基因Actin相比，該基因在病菌侵染水稻的48 h后表達量最大。該結果與筆者之前基因芯片的結果一致（侵染過程中上調表達，log值為2.906）。因此，MGG14093基因可能參與稻瘟病菌的致病過程。 2.3 MGG14093基因敲除突變體與過量表達突變體的獲得

MGG14093基因敲除轉化子PCR驗證結果見圖2，△ku80對照（泳道4）可擴增到MGG_14093基因的ORF片段，因不含潮霉素基因，未擴增到A片段上游71 bp到潮霉素內部引物間的的UAH片段。異位整合突變體（ectopic）由于潮霉素基因片段的插入位點不在ORF內，所以也未擴增到UAH片段（泳道2），但卻能在添加潮霉素的培養基上生長。MGG14093基因的2個敲除突變體，分別命名為△ko21和△ko38，則未擴增到MGG14093的ORF，卻可擴增UAH片段（泳道1和3），因為該基因的ORF被潮霉素基因所替代。

MGG14093基因ORF插入到pET11載體上，由RP27強啟動子驅動下過量表達。隨機挑選過表達轉化子，用RT-PCR方法驗證基因的表達水平。結果發現，多數轉化子中MGG14093均有過量表達，其中Oe2和Oe3是表達量較高的過量表達突變體。

2.4 MGG14093基因突變體生長和產孢情況

MGG14093基因敲除突變體和過量表達突變體的產孢量統計、菌落直徑的測量結果表明，p值都大于0.05，目的基因的缺失突變體和過量表達突變體在生長速度、產孢量、孢子萌發率及附著孢形成上均與對照無顯著差異（圖3和表3）。

2.5 MGG14093突變體的致病性分析

MGG14093基因敲除突變體和過量表達突變體的致病性分析結果發現，在清水對照不致病的基礎上，與陽性對照△kou80相比，基因缺失突變體（△ko21和△ko38）對水稻的致病性沒有明顯改變，但基因過量表達突變體的致病力降低，表現為感病病斑數明顯減少（圖4）。

3 討論與結論

查尋稻瘟病菌基因表達公共數據庫發現，MGG14093基因分子量低，并且在該菌的各個生長發育階段的表達量均很低。本試驗通過RT-PCR實驗結果發現，與Actin相比，該基因的總體表達量均較低，但在病菌侵染水稻后48 h時表達量升高較為明顯，說明該基因在稻瘟病菌的侵染初期可能有一定的功能。在線工具ExPASy預測結果發現，MGG14093蛋白可能存在幾處氨基酸活性位點（如環腺苷酸磷酸化位點等），而這些可能存在的磷酸化或者乙酰化位點或許對于蛋白質功能的發揮至關重要。SignalP和ProtComp分析結果發現，MGG14093為定位于胞外的分泌蛋白。而病原真菌分泌蛋白通常起著細胞壁降解酶或者效應子的功能[12]。植物對病原菌的免疫主要方式有2種，一是通過引發病原相關的分子模式（PAMP）PTI進行免疫，二是由病原的個別效應子誘發植物的免疫反應（ETI）[13-14]。效應子通常能夠增加或者降低酶的活性、細胞表達或細胞信號。病原真菌的效應子作用于寄主細胞或外質體，可能與糖基化有關，能夠抑制植物的免疫反應[15]。如效應子Slp1通過Alg3介導的α-1，3-甘露糖基轉移酶Ⅱ調節稻瘟病菌Slp1的N端糖基化，隔離幾丁質低聚糖與水稻幾丁質激發子結合蛋白CEBiP受體之間的結合而避免被水稻識別[15-16]，從而阻止了由幾丁質誘發的寄主免疫[17]。大部分的效應子通常是分子量小的分泌蛋白，通常缺乏與已知蛋白的同源性[18-19]，同源比對結果發現，MGG_14093與已知蛋白都沒有同源性，說明它可能不是一種胞外酶，而有可能是稻瘟病菌的一種效應蛋白，在稻瘟病菌中的定殖和擴展過程中有著重要的功能。

MGG14093基因的敲除和過量表達突變體，在生長速度、產孢量、孢子萌發率和附著孢的形成率上與△ku80對照無明顯區別，說明該基因可能不參與稻瘟病菌的生長、產孢和附著孢分化。而且MGG14093基因敲除突變體在致病性方面也無顯著的改變，說明該基因可能存在功能冗余。Hiromasa等[12]在研究效應子的過程中，對稻瘟病菌侵染水稻早期都有表達的78個分泌蛋白基因進行了敲除，大部分的突變體對生長、致病性及產孢量都沒有影響，mc69突變體對生長速度、分生孢子的產生及附著孢的成熟都沒有影響，只是在附著孢成熟后不能成功的形成侵染菌絲；稻瘟病菌效應子基因敲除后致病性無變化也是一種常見的現象[10]。本試驗結果發現，MGG14093基因過量表達后導致了病菌的致病性減弱，說明該基因的編碼蛋白可能是具有激發子功能的效應蛋白，該功能還需通過其它實驗進一步驗證。

參考文獻

[1] Talbot N J. On the trail of a cereal killer： Exploring the biology of Magnaporthe grisea[J]. Annu Rev Journal of Microbiol， 2003， 57（1）： 177-202.

[2] Ou S H. Rice diseases[M]. UK： Commonwealth Agricultural Bureaux， 1985： 380.

[3] Zeigler R S， Leong S A， Teong P S. Rice blast disease[M]. Los Banos： CAB International， 1994： 626.

[4] Veneault F C， Talbot N J. Moving toward a systems biology approach to the study of fungal pathogenesis in the rice blast fungus Magnaporthe grisea[J]. Advances in Applied Microbiology， 2005， 57（1）： 177-215.

[5] Adachi K， Hamer J E. Divergent cAMP signaling pathways regulate growth and pathogenesis in the rice blast fungus Magnaporthe grisea[J]. Plant Cell， 1998， 10（7）： 1361-1373.

[6] Liu T B， Chen G Q， Min H， et al. MoFLP1， encoding a novel fungal fasciclin-like protein，is involved in conidiation and pathogenicity in Magnaporthe oryzae[J]. Zhejiang Univ Sci，2009， 10（3）： 434-444.

[7] Ridout C J， Skamnioti P， Porritt O， et al. Multiple avirulence paralogues in cereal powdery mildew fungi may contribute to parasite fitness and defeat of plant resistance[J]. Plant Cell，2006， 18（12）： 2 402-2 414.

[8] Frank F， Neha P， Jeffrey B J， et a1. The type Ⅲ effectors of Xanthomonas[J]. Molecular Plant Pathology， 2009， 10（6）：749-766.

[9] Kang S， Sweigard J A， Valent B. The PWL host specigictty gene gamily in the blast fungus Magnaporthe grisea[J]. Mol Plant Microbe Interact， 1995， 8（4）： 939-948.

[10] Valent B， Chang H K. Recent advances in rice blast effector research[J]. Current Opinion in Plant Biology， 2010， 13（3）：434-441.

[11] Wu L M， Bian W Y， Hu F H， et al. Functional analysis of a putative phenylacetone monooxygenase gene（MoPAMO1）in Magnaporthe oryzae[J]. Agricultural Biotechnology， 2013， 5（3）： 595-602.

[12] Hiromasa S， Shizuko F， Chikako M， et al. Large-scale gene disruption in Magnaporthe oryzae identifies MC69， a secreted protein required for infection by monocot and dicot fungal pathogens[J]. Plos Pathogens， 2012， 8（1）： 1-16.

[13] Azizi P， Rafii M Y， Abdullah S N， et al. Toward understanding of rice innate immunity against Magnaporthe oryzae[J]. Crit Rev Biotechnol， 2014， 8（1）： 1-10.

[14] Zhou X， Zhao X， Xue C， et al. Bypassing both surface attachment and surface recognition requirements for appressorium formation by overactive ras signaling in Magnaporthe oryzae[J]. Mol Plant Microbe Interact， 2014， 27（9）： 996-1 004.

[15] Chen X L， Tao S， Yang J， et al. N-Glycosylation of effector proteins by an a-1，3-Mannosyltransferase is required for the rice blast fungus to evade host innate immunity W OPEN[J]. The Plant Cell， 2014， 26（7）： 1 360-1 376.

[16] Mentlak T A， Kombrink A， Shinya T， et al. Effector-mediated suppression of chitin-triggered immunity by Magnaporthe oryzae is necessary for rice blast disease[J]. Plant Cell， 2012， 24（2）： 322-335.

[17] Shimizu T， Nakano T， Takamizawa D， et al. Two LysM receptor molecules， CEBiP and OsCERK1，cooperatively regulate chitin elicitor signaling in rice[J]. Plant Journal， 2010， 64（1）： 204-214.

[18] Ellis J G， Rafiqi M， Gan P， et al. Recent progress in discovery and functional analysis of effector proteins of fungal and oomycete plant pathogens[J]. Curr Opin Plant Biol， 2009， 12（2）： 399-405.

[19] Hogenhout S A， van der Hoorn R A， Terauchi R， et al. Emerging concepts in effector biology of plant-associated organisms[J]. Mol Plant Microbe Interact， 2009， 22（1）： 115-122.