木糖篩選系統對杜鵑紅山茶愈傷組織誘導及生長的影響

王江英　吳斌　范正琪　李紀元

摘 要 在農桿菌介導的遺傳轉化過程中，抗生素不同程度地抑制山茶轉化體的生長與分化。以木糖異構酶基因xylA為篩選標記，試圖建立杜鵑紅山茶（Camellia azalea）遺傳體系過程中的非抗生素篩選系統。從大腸桿菌Top10中擴增出xylA基因，并用其替換經改造的植物表達載體pCAMBIA1300中的hptⅡ基因，獲得植物表達載體pCAMBIA1300-xylA并導入根癌農桿菌EHA105中，經農桿菌介導轉化煙草結果表明，xylA標記基因可以替代卡那霉素應用于煙草轉化體中，且效果更優。以杜鵑紅山茶帶柄葉片、莖段、子葉為外植體誘導的愈傷組織，生長狀態均表現良好，愈傷組織啟動誘導的所需天數比對照組提前約10 d，生長量為對照組的1.5～2.5倍。可以認為25 g/L的木糖濃度是適合杜鵑紅山茶愈傷組織誘導及生長的篩選濃度。

關鍵詞 杜鵑紅山茶；愈傷組織；誘導；生長；木糖篩選

中圖分類號 S685.14 文獻標識碼 A

杜鵑紅山茶（Camellia azalea）自然分布于廣東省陽春市鵝凰嶂自然保護區，四季著花，夏季盛花，花色艷麗，是中國特有的山茶遺傳種質，也是培育四季茶花新品種的特異親本。杜鵑紅山茶的雜交育種已取得突破性進展[1-2]。通過分子生物學技術將不同功能的外源基因導入杜鵑紅山茶中，以加速培育抗逆性強的杜鵑紅山茶特異新品種勢將成為新的發展趨勢之一。然而，山茶屬植物離體再生困難，轉化效率低，最終轉基因成功的報導極少，僅山茶屬的茶樹（Camellia sinensis）通過農桿菌介導法和卡那霉素（Kanamycin）篩選體系成功獲得轉基因植株[3]。范正琪等[4]發現卡那霉素、潮霉素（Hygromycin）對山茶愈傷組織誘導及生長有較大的影響，抗生素濃度較高時，愈傷組織容易褐變，分化狀態不佳，因此未能獲得再生植物。轉基因桃及楊樹的實驗中也發現較高濃度的卡那霉素會抑制轉基因植株的再生甚至完全抑制芽的分化[5-6]。

1996年Joersbo等[7]發現糖基因參與的正向選擇系統可以解決植物組織對抗生素敏感的問題，其中木糖異構酶基因（xylose isomerase，xylA）通過編碼的木糖異構酶，將木糖轉變為植物可利用的木酮糖，從而達到篩選細胞的作用[8-10]。目前木糖篩選系統已在玉米、花生及黃瓜等植物中獲得成功[11-13]，然而將此系統應用于山茶方面的研究尚未見報道。

筆者以杜鵑紅山茶帶柄葉片、莖段、子葉為外植體，以木糖為篩選系統，研究其對杜鵑紅山茶不同外植體愈傷組織誘導及植株再生的影響，為優化杜鵑紅山茶高效穩定的遺傳轉化體系提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

以煙草及杜鵑紅山茶帶柄葉片、莖段及子葉為組培材料。農桿菌EHA105、pCAMBIA1300載體為本實驗保存，大腸桿菌Top10感受態細胞購自北京全式金生物有限公司，大腸桿菌DH5α購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大腸桿菌xylA基因的擴增 大腸桿菌Top10基因組DNA提取參照試劑盒說明書進行。根據GenBank中登錄的xylA基因序列（GenBank登錄號：X04691）設計引物，上下游引物5' 端添加XhoⅠ酶切位點。F1：5′-CCGCTCGAGATGCAAGCCTATTT

TGACC-3′；R1：5′-CCGCTCGAGTTATTTGTCGAA

CAGATAA-3′。以大腸桿菌Top10基因組DNA為模板，高保真酶擴增xylA基因全長。

1.2.2 植物表達載體pCAMBIA1300-xylA構建

用XhoⅠ酶分別酶切pCAMBIA1300和pGEM-T-xylA，回收pCAMBIA1300載體大片段和pGEM-T-xylA的小片段，T4 DNA連接酶16 ℃過夜連接大小片段。XhoⅠ酶切檢驗xylA是否插入，PCR檢測插入片段的方向。檢測引物為CaMV35S promoter末尾端的一段序列及CaMV35S polyA初始端的一段序列，分別為F2：5′-GATGTGATATCTCCACTG

ACG-3′；R2：5′-AGCTTGTCGATCGACAGATC-3′。

1.2.3 xylA基因在模式植物中的功能鑒定 將pCAMBIA1300-xylA轉化到根癌農桿菌EHA105中，利用改良的Horsch“葉盤法”轉化煙草[14]，外植體為生長旺盛的煙草無菌苗葉片，將其剪成1 cm×1 cm的葉盤，無需預培養，直接進行農桿菌侵染15 min，無菌水沖洗5次，共培養2 d后，轉至誘導培養基中進行愈傷組織誘導。其中共培養基組分為：MS（30 g/L蔗糖）+2.25 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA+6.5 g/L植物瓊脂，愈傷組織誘導及分化培養基為：MS（15 g/L蔗糖+15 g/L木糖）+2.25 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA+6.5 g/L植物瓊脂+200 mg/L Tim （特美汀，Timentin），不定芽生根培養基為：1/2 MS（15 g/L蔗糖+15 g/L木糖）+6.5 g/L植物瓊脂+200 mg/L Tim[11-13，15]。對照組為空載體pCAMBIA1300轉EHA105，共培養基同實驗組，愈傷組織誘導、分化培養基及不定芽生根培養基中碳源為30 g/L蔗糖，另外添加50 mg/L Kan，其余組分同實驗組。每組50個葉盤，重復3次。

觀察煙草遺傳轉化過程中木糖對轉化體的影響，統計愈傷誘導率、不定芽及生根數量，檢測并統計轉基因煙草陽性轉化率，其中PCR檢測引物實驗組為xylA基因全長上下游引物：F3：5′-ATG

CAAGCCTATTTTGACC-3′，R3：5′-TTATTTGTCGA

ACAGATAA-3′；對照組為hptⅡ基因全長上下游引物F4：5′-ATGAAAAAGCCTGAACTCACCGC-3′，R4：5′-CTATTTCTTTGCCCTCGGAC-3′。

1.2.4 杜鵑紅山茶各外植體木糖篩選體系的建立

本實驗借鑒山茶‘耐冬愈傷組織誘導培養基[16]，以杜鵑紅山茶帶柄葉片、莖段、子葉為外植體一共設計7組實驗，保證30 g/L總碳源不變的情況下，將未侵染的外植體放入不同木糖濃度（0、5、10、15、20、25、30 g/L）的愈傷誘導培養基中，分別于30、30、45 d觀察帶柄葉片、莖段以及子葉生長狀態，并且統計愈傷誘導率，確定木糖在培養基中達到篩選作用的理想濃度。

1.2.5 木糖對杜鵑紅山茶愈傷組織誘導及生長的作用

利用改良的Horsch“葉盤法”[14]將帶有pCAMBIA1300-xylA的農桿菌EHA105轉化生長旺盛的杜鵑紅山茶帶柄葉片、莖段、子葉等外植體。首先將外植體預培養7 d，根癌農桿菌侵染20 min后，無菌水沖洗5次，共培養2 d，其中預培養基及共培養基組分同‘耐冬愈傷誘導培養基，然后將侵染后的外植體轉移到添加5 g/L蔗糖+25 g/L木糖及200 mg/L Tim的愈傷誘導培養基中進行培養，木糖篩選；pCAMBIA1300侵染后的各外植體在添加30 g/L 蔗糖及200 mg/L Tim的愈傷誘導培養基中培養，以卡那霉素篩選作對照。觀察愈傷組織出現時間、愈傷組織生長狀態并統計其生長量，其中生長量統計時實驗組和對照組所對應的外植體質量相同，本實驗中帶柄葉片總質量為5.2 g、莖段總質量為3.0 g、子葉總質量為6.5 g，實驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 xylA基因獲得及其酶切驗證

以提取的大腸桿菌Top10基因組DNA為模板，F1、R1為引物進行PCR擴增，獲得約1.3 kb的目的條帶（圖1-a）。1%瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收、產物連接到pGEM-T載體上，轉化大腸桿菌DH5α后，XhoⅠ酶切驗證重組質粒（圖1-b），挑取陽性克隆測序，測序結果表明該片段大小為1 323 bp，與GenBank公布的xylA序列基本一致，表明擴增的片段為大腸桿菌xylA基因。

2.2 pCAMBIA1300-xylA重組載體的鑒定

pCAMBIA1300-xylA的重組區域如圖2所示，xylA替換pCAMBIA1300載體中hptⅡ基因。由于hptⅡ基因兩端酶切位點均為XhoⅠ，擴增xylA基因的上下游引物引入了XhoⅠ酶切位點，因此xylA可能以正反兩種方向插入到載體上。重組載體鑒定時首先用XhoⅠ酶切驗證xylA基因的插入，如圖3-a初步表明1、3、4、5號有xylA基因的插入。然后在pCAMBIA1300載體CaMV35S promoter末尾端設計的一條上游引物F2，在CaMV35S polyA初始端設計一條下游引物R2，xylA基因片段正向插入時可擴增出預期1 532 bp的條帶，反向插入則無條帶，圖3-b表明8、9、10號為xylA基因的正向插入重組子。

2.3 xylA基因對模式植物遺傳轉化的影響

以xylA作標記基因的實驗組煙草葉盤翠綠色，10 d后愈傷組織及不定芽原基出現，15 d后不定芽分化，愈傷組織及不定芽生長健壯，表面濕潤，呈碧綠色，數量也較多，不定芽移入生根培養基中7 d后生根，主根發達，側根密集（圖4）。以卡那霉素篩選的對照組葉盤淺黃色，15 d后愈傷組織出現，20 d后不定芽分化，愈傷組織及不定芽呈黃綠色，數量較實驗組少，不定芽移入生根培養基中12 d后生根，主根纖細，幾乎無側根（圖5）。

農桿菌侵染后，經統計實驗組愈傷組織誘導率比對照組高出13%（圖6-a），不定芽數量約為對照組的2.7倍（圖6-b），生根30 d后發現實驗組不定芽主根及側根數約為對照組3.1倍（圖6-c）。

選取20株pCAMBIA1300-xylA轉基因煙草待測植株，提取基因組DNA，PCR擴增鑒定陽性植株及統計陽性率（圖7），20株對照組待測植株作對照（圖8）。結果發現，陽性植株實驗組18株、對照組10株。經統計木糖篩選的陽性率約為卡那霉素篩選的1.8倍。

2.4 杜鵑紅山茶各外植體木糖篩選濃度的優化

木糖篩選體系建立過程中發現，帶柄葉片及莖段的愈傷組織出現時間較子葉提前，且生長速度也較快。3種外植體在添加不同濃度的木糖培養基中生長狀態良好，隨著木糖濃度的增加，愈傷組織數量逐漸遞減（表1），表明木糖可以抑制愈傷組織生長，其中6號培養基即木糖和蔗糖濃度比為25 g/L：5 g/L時，外植體的愈傷誘導率驟減，利用SPSS19.0軟件進行多組樣本間差異顯著性分析發現6號與1～5號培養基下的愈傷誘導率均呈顯著差異，p﹤0.05，說明此濃度比可以有效抑制各外植體形成愈傷組織，該木糖濃度可以作為理想篩選濃度。當木糖和蔗糖濃度比達30 g/L：0 g/L時（即7號培養基），與1～6號培養基中的愈傷誘導率進行分析，也發現均呈顯著差異，然而7號培養基完全抑制愈傷組織形成，因此不適合作為理想篩選濃度。

觀察圖9-a、b、c可以發現，帶柄葉片、莖段和子葉均在6號培養基中即木糖和蔗糖濃度比為25 g/L∶5 g/L，愈傷組織生長明顯減少，7號培養基即30 g/L∶0 g/L時，無愈傷組織形成，更加說明木糖濃度為25 g/L時對外植體能夠有效的起到篩選作用。另外，經觀察還發現，含少量木糖的培養基（如2、3號培養基）中的愈傷組織比1號全蔗糖培養基的組織質地較幼嫩、疏松。

2.5 木糖篩選系統對杜鵑紅山茶愈傷誘導及生長的作用

實驗組pCAMBIA1300-xylA侵染后的杜鵑紅山茶帶柄葉片、莖段約15 d 出現愈傷組織，25 d觀察愈傷生長量，發現帶柄葉片的愈傷量較莖段的少（圖10 a-Test、b-Test）；子葉約20 d才有愈傷出現，40 d后觀察愈傷生長量，子葉盤邊緣及表面均出現愈傷，愈傷組織泛紅，表面濕潤、疏松（圖10-c-Test）。對照組pCAMBIA1300侵染后的帶柄葉片、莖段在15 d時，只有極少量愈傷出現，25 d時帶柄葉片主脈及傷口處才膨化（圖11-a-CK），莖段頂端及葉柄處出現少量愈傷（圖10-b-CK）；對照組子葉20 d幾乎無愈傷出現，40 d時只有邊緣有愈傷組織生長，質地緊密，較少泛紅，中間無愈傷且干澀（圖10-c-CK）。農桿菌侵染50 d后，帶柄葉片、莖段、子葉的愈傷生長量分別為對照的1.8倍、2.5倍、1.5倍（圖11）。由此推測，木糖篩選系統對杜鵑紅山茶莖段愈傷組織的生長效果最好，其次為帶柄葉片，最后為子葉。

3 討論與結論

本研究以xylA為篩選標記，在煙草遺傳轉化過程中以15 g/L木糖作篩選濃度，獲得的轉化體比對照組生長更旺盛，愈傷組織誘導及不定芽萌發更早，其中愈傷組織誘導率比對照組約高出13%，不定芽及生根數量分別為對照的2.7倍和3.1倍。更為重要的是轉基因煙草陽性率提高近1倍。這些結果表明，xylA基因在本研究中能夠代替抗生素起到高效的篩選作用，因此木糖篩選系統在模式植物煙草遺傳轉化過程中是可行的。雖然有研究認為，以xylA作標記基因，以木糖作為唯一碳源來篩選轉化煙草細胞時，其篩選效果不如卡那霉素篩選系統[17]。其可能的原因是木糖作唯一碳源對植物細胞生長有毒害作用。在黃瓜及馬鈴薯的研究中發現木糖為唯一碳源時，外植體褐化死亡率較高，成苗率更低[13，18]。因此在木糖作篩選標記時，應避免以木糖作為唯一碳源。

本研究成功建立了杜鵑紅山茶帶柄葉片、莖段、子葉等外植體的木糖篩選系統。在30 g/L總糖的培養基中，25 g/L木糖+5 g/L蔗糖及30 g/L木糖的濃度均抑制了3種不同外植體愈傷組織的生長，表明木糖篩選的理想濃度與杜鵑紅山茶外植體的種類無關。實驗過程中還發現5 g/L木糖+25 g/L蔗糖及10 g/L木糖+20 g/L蔗糖組合相對于0 g/L木糖+30 g/L蔗糖組合所誘導的愈傷組織顏色均翠綠，可能是因為全蔗糖培養基中愈傷組織生長較快，組織易泛白、老化，而低濃度的木糖對愈傷組織生長僅有輕微抑制作用，愈傷組織細胞一直處于快速分裂狀態，這有利于后期不定芽的誘導。由于以木糖為單一碳源對植物細胞有毒害作用，我們認為25 g/L的木糖濃度可作為杜鵑紅山茶理想的篩選濃度，這與黑麥草的研究結果一致[19]。考慮到本實驗僅設定了7種木糖濃度，在后續的實驗中仍需將梯度進一步細化以獲取更為優化的木糖篩選濃度。玉米、花生遺傳轉化過程中發現合適的木糖篩選濃度更為寬泛[11-12]。因此還需要考慮不同物種對木糖耐受力的情況，優化其木糖最佳篩選濃度應用于遺傳轉化體系中。

大量研究發現，農桿菌介導的遺傳轉化過程中抗生素會抑制愈傷組織生長、不定芽分化，從而影響很多物種遺傳轉化的穩定建立，在木本植物中更是如此。在楊樹、刺槐、桑樹及桉樹等木本植物的遺傳轉化過程中，發現愈傷組織對卡那霉素極為敏感，嚴重時愈傷組織很快褐變死亡，少有不定芽的成功分化[6，20-21]。一些藤本植物葡萄組織對卡那霉素也非常敏感，即使在相對較低的濃度時，也會抑制組織再生[22]。草本花卉植物，如非洲菊，對卡那霉素及潮霉素也非常敏感，隨著抗生素濃度的增加，獲得的愈傷組織越來越少且狀態不佳，不定芽分化也明顯下降，甚至整個外植體褐變加劇而死亡[23]。對抗生素敏感的植物而言，可以考慮選用糖類篩選系統，應用于遺傳轉化系統中。本實驗將木糖篩選系統初步應用到杜鵑紅山茶遺傳轉化體系建立中，以xylA作篩選標記時愈傷誘導天數提前約5 d，轉化體生長狀態良好，愈傷組織數量也較多，為卡那霉素篩選的1.5～2.5倍，雖然沒有煙草那么明顯，但優化后的木糖篩選系統是適合于杜鵑紅山茶再生體系的。

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