花生種子中芪化物的合成與抗黃曲霉菌產毒的相關性研究

王琴飛　王明　李莉萍　高玲　應東山　張如蓮

摘 要 以花生種子為試材，采用孢子濃度為1×106（個/mL）的黃曲霉菌接種花生種子，對抗產毒和易產毒品種間4種主要芪化物（resveratrol， ε-viniferin， δ-viniferin， pterostilbene）合成變化，相關抗性酶活性（PAL、POD、PPO）進行了比較，探討了不同品種間芪化物的合成與抗黃曲霉菌產毒之間的相關性。結果表明：花生種子芪化物的合成速度與抗產毒有關。在接種黃曲霉菌第3天時，抗產毒品種黔花生3號4種芪化物含量達到峰值，含量為47.37 μg/g，為對照的54倍；易產毒品種花育22號芪化物含量僅5.5 μg/g；抗產毒品種芪化物含量和相關抗性酶（PAL、POD、PPO）活性都高于易產毒品種；在16個考察的花生品種中，發現了4個芪化物含量較高，病情指數和黃曲霉毒素含量相對較低的花生品種；相關分析發現，不同花生品種芪化物含量與病情指數、黃曲霉毒素B1和黃曲霉毒素總量呈極顯著負相關，相關系數（r）分別為-0.789、-0.851、-0.850。因此，花生接種第3天時的芪化物含量可作為篩選和培育花生抗產毒品種的重要化學指標。

關鍵詞 花生；芪化物；黃曲霉菌；抗性

中圖分類號 R151.3 文獻標識碼 A

白藜蘆醇（Resveratrol，Res）廣泛存在于多種植物如葡萄、虎杖、花生中，化學名為3，5，4′-三羥基-反-二苯乙烯（3，5，4′-trihydroxysitlbene），是一種含有芪類結構的非黃酮類多酚化合物。1976年Ingham[1]首次在花生中分離得到了順、反式白藜蘆醇，在植物體中以穩定的反式異構體為主。以白藜蘆醇為基本單元氧化合成的聚合體稱為衍生物或芪化物[2-4]。研究證實，很多芪化物是Res在植物體內的代謝產物[5]，目前在植物體內檢測并穩定存在的有云杉苷（Picied，PD），Res二聚體（ε-viniferin、δ-viniferin）和紫檀芪（Pterostilbene，PS）等[6]，具有與Res相似或更高的生物活性[7]，常作為植物的抗病指標被深入研究[8-9]。

花生作為一種重要的“美味食品”和油料來源，受黃曲霉菌侵染后產生的黃曲霉毒素是公認的強致癌物質，已成為影響花生生產、加工和貿易的世界性問題。而培育和篩選抗黃曲霉菌產毒和自身抗病的花生品種是解決此問題最有效和最經濟的途徑。研究發現，在花生種子、花生油、花生愈傷組織中存在多種芪化物[10-11]。而花生種子切割或受病原菌感染后，可產生Res和trans-IPD有關的植保素，此類物質是花生受到黃曲霉侵染后產生的主動抗性因素（植物保衛素）[12]。近年來，研究者在花生根端粘液組織和受黃曲霉菌、曲霉菌等真菌侵染的花生種子中，發現了多種白藜蘆醇異戊烯基類衍生物[13-14]，并且不同基因型的花生品種，Res異戊烯基類衍生物種類和含量都各不相同，受侵染后芪化物含量較低的花生品種也容易受番茄斑萎病毒和晚期葉斑病毒的侵染，而不同基因型的花生品種在沒有受到傷害時，芪化物含量無顯著的差異[15]。因此認為這些芪化物可作為花生抗病和抗逆品種選育的潛在化學指標。也有研究者證實，花生種子在受黃曲霉菌侵染后，Res的合成速率與品種的抗-感病性有關，抗產毒品種合成高峰早于易產毒品種[16]。另外，吸脹處理花生種子可提高花生品種（系）中白藜蘆醇含量，吸脹后的花生種子接種黃曲霉菌后，黃曲霉毒素含量與白藜蘆醇含量呈顯著負相關，并且在離體培養基中證明了Res對黃曲霉菌產毒具有抑制作用[17]。筆者前期研究發現，在接種黃曲霉菌的花生種子中檢測到了6種芪化物，其中Res、PS和2種白藜蘆醇二聚體（ε-viniferin、δ-viniferin）在相同品種的花生種子中合成量受種植環境影響較大，與種植年度相關性較小；相同的種植條件下，不同品種4種芪化物的含量與侵染率呈負相關[18]，而同時以多種芪化物考察不同的花生品種的抗產毒能力還未見報道。在此研究基礎上，探索感-抗花生品種接種黃曲霉菌后4種主要芪化物（Res、PS、ε-viniferin、δ-viniferin）總量合成與相關抗性酶活性變化的差異；確定合適的接種時間，對不同品種中芪化物含量與病情指數、黃曲霉毒素含量之間相關性進行分析，探討芪化物的合成與抗黃曲霉菌產毒之間的相關性，為培育和篩選高含量芪化物并抗產毒的花生品種提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用的花生品種來源如表1所示，于2012年春季種植于農業部植物新品種測試（儋州）分中心，種子采收后自然晾干，儲存于種子低溫低濕儲藏柜中（濕度：40%，溫度4～8 ℃）。黃曲霉菌（Aspergillus flavus，3.289 0）購買于中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會。黃曲霉毒素B1、B2（Sigma公司，純度≥98%）；Res（Sigma公司，純度≥98%），PS（杭州廣林生物醫藥有限公司，純度≥99%），ε-viniferin由中國農業大學食品與營養工程學院李景明教授饋贈（純度≥95%）；δ-viniferin參照Pezet等[19]的研究方法制備（純度≥95%）。甲醇、乙腈（色譜純），美國Sigma公司；超純水。高效液相色譜儀（配備四元梯度泵LC2130，自動進樣器L2200，紫外檢測器LC2030，L-2485熒光檢測器，柱溫箱LC2061），日本Hitachi公司；芪化物的檢測采用色譜柱Purospher STAR RP-18e（Hiber 150 mm×4.6 mm，5 μm），購買于德國Merck公司；黃曲霉毒素B1、B2的檢測采用色譜柱：Gemini C18（110A 250 mm×4.6 mm，5 μm），購買于美國Phenomenex公司；Mycosep228凈化柱用于黃曲霉毒素的凈化（美國Romer Labs公司）；超純水采用Elix3+Synergy超純水系統制備（美國Millipore公司）；超聲波清洗器用于芪化物和黃曲霉毒素的提取（KQ-400KDE，江蘇昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 花生種子黃曲霉菌的接種 選取飽滿、大小均勻無損的不同品種花生種子20粒，用70%的酒精表面消毒3 min，無菌水沖洗3次，無菌水開始浸泡到沖洗完畢的時間控制在13 min 以內， 保證種子在復水之后含水量保持在20%左右[17]。在超凈工作臺中，將消毒后的花生種子置于滅菌的培養皿中，每培養皿中加入1 mL孢子懸浮液1×106（個/mL），使每粒種子均勻粘上黃曲霉菌孢子，無菌水處理為對照，實驗設置3個重復，28 ℃下暗培養，分別于接種后0、1、3、5、7 d取出，同時記錄侵染率[20]。接種后的花生種子，液氮研磨成粉末后，-70 ℃冰箱保存待用。

同上方法接種16個不同花生品種（表1）的種子20粒，實驗設置3個重復。接種3 d后取出，統計受黃曲霉菌侵染達1/3粒數、2/3粒數和全部侵染粒數，計算不同品種的病情指數[20]。用70%酒精表面消毒種子3 min，在110 ℃烘箱中烘烤1 h。種子冷卻后研磨成粉末，-40 ℃冰箱保存，用于檢測黃曲霉毒素。

1.2.2 芪化物的提取與檢測 參照王琴飛等[18]的研究方法提取和檢測芪化物，其色譜條件為：采用三元梯度洗脫，流動相A為乙腈，B為水，C為2%甲酸水溶液。起始為5% A， 93% B，2% C（之后C相始終保持2%的比例），保持3 min；到30 min時A為60%，B為38%；37 min時A為85%，B為13%，保持3 min；到40 min時A為5%，B為93%。平衡柱子，進下一個樣。流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃； 檢測波長為306 nm；進樣體積為20 μL。采用外標法定量，每個樣品設置3次重復。

1.2.3 PAL、POD、PPO活性測定 苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia lyase，PAL）活性測定：準確稱取0.5 g花生種子粉末于10 mL離心管中，加入5 mL 0.1 mol/L硼酸緩沖液（內含5 mmol/L巰基乙醇，pH8.8），搖勻，4 ℃下11 000 ×g離心15 min，上清液即為酶提取液。反應體系包括：酶提取液0.5 mL、L-苯丙氨酸（0.02 mmol/L）1 mL、蒸餾水2.5 mL。混勻后37 ℃水浴1 h，加入0.2 mL HCl（6 mol/L）終止反應，用紫外分光光度計OD290值。以煮沸的酶液為對照，以⊿OD290值變化0.01為一個酶活性單位（U），結果以U/mg Pr/h計。實驗重復3次。蛋白測定采用考馬斯亮藍染色法。

過氧化物酶（Peroxidase， POD）活性測定：采用愈創木酚顯色法，準確稱取0.5 g花生種子粉末于10 mL離心管中，加入5 mL提取緩沖液（含1 mmol PEG、4%PVPP和1%Trion X-100），搖勻，4 ℃下11 000×g離心15 min，上清液即為酶提取液。反應體系包括：0.1 mL酶提取液，3 mL 0.025 mol/L愈創木酚溶液，0.4 mL 0.05 mol/L的醋酸緩沖液，最后再加入200 μL 0.5 mol/L H2O2溶液啟動反應。記錄1 min內OD470變化值，結果以⊿OD470改變0.01為1個酶活性單位（U），結果以U/（mg Pr·min）計。實驗重復3次。

多酚氧化酶（Polyphenol oxidase， PPO）活性測定：酶液提取同POD。反應體系包括：酶液0.1 mL、0.05 mol/L鄰苯二酚溶液2.0 mL、0.05 mol/L磷酸緩沖液（pH6.8）1.5 mL。于 30 ℃下反應5 min，加入酶反應計時，測定5 min之內OD420值。以⊿OD420值變化0.01為1個酶活性單位（U），結果以U/（g FW·min）計。實驗重復3次。

1.2.4 花生種子中黃曲霉毒素的提取及檢測 參照朱孟麗[21]方法稍作修改。稱取參試的不同品種花生種子粉末2.0 g于15 mL離心管中，加入10 mL 乙腈：水（84/16）溶液，混勻后，超聲提取30 min，8 000×g離心20 min，收集上清液為提取液。凈化：移取8 mL提取液至凈化柱的玻璃管中，緩慢推注，得到凈化液。衍生：取2 mL 凈化液至棕色具塞瓶中，在60 ℃水浴下以氮氣柔和吹干，加入200 μL正已烷和100 μL 衍生液，混勻30 s后，在40 ℃干燥箱中衍生15 min，在室溫下蒸發后以水 ∶ 乙腈（85 ∶ 15）200 μL溶解，混勻30 s，8 000×g離心15 min，取上清液過0.22 μm的有機相膜，待上樣分析。

色譜條件：流動相A為乙腈，B為水。起始為20% A，80% B，到8 min時A為30%，B為70%；10 min時A為40%，B為60%；到15 min時A為20%，B為80%。平衡柱子，進下一個樣。流速：1.2 mL/min；激發波長：360 nm；發射波長：440 nm；進樣量：10 μL；柱溫30 ℃。采樣外標法定量。

1.3 數據分析

采用Microsoft Excel和SPASS 22.0統計軟件做相關性分析；采用Sigmaplot12.5畫圖軟件繪制圖形。

2 結果與分析

2.1 花生種子接種黃曲霉菌后4種芪化物和黃曲霉毒素的HPLC測定

以白藜蘆醇的最大吸收波長306 nm為檢測波長，對Res、ε-viniferin、δ-viniferin、PS 4種芪化物進行檢測，濃度為10 μg/mL標準樣品的HPLC色譜圖見圖1，樣品中的4種芪化物也得到較好的分離，保留時間分別為 18.182、21.568、23.257、30.832（圖1-A），與標樣保留時間基本一致（圖1-B）。Res、ε-viniferin、δ-viniferin、PS在接種后的花生品種中都存在并相對含量較高，與黃曲霉菌抗病相關性較高[18]，因此實驗僅對這4種芪化物進行了檢測。以該方法對4種芪化物的不同濃度與對應的峰面積做標準曲線，相關性較好，Res、ε-viniferin、δ-viniferin、PS 4種芪化物相關系數（R2）分別為：0.999 0、0.999 3、0.999 5、0.999 9。

當黃曲霉毒素B1、B2的濃度分別為100 ng/mL時，標準樣品的色譜圖如圖2所示，樣品中黃曲霉毒素B1、B2的保留時間分別為4.293、7.327（圖2-A），保留時間與標樣基本一致（圖2-B）。該黃曲霉菌菌種主要產生黃曲霉毒素 B1和 B2，所以樣品中僅檢測黃曲霉毒素B1和B2。以該方法對黃曲霉毒素B1、B2的不同濃度與對應的峰面積做標準曲線，相關性較好，相關系數（R2）都為：0.999 0。

2.2 接種黃曲霉菌后侵染率、芪化物含量和抗性相關酶活性的變化

2.2.1 接種黃曲霉菌后侵染率的變化 對接種后抗侵染花生品種黔花生3號和易感品種花育22號進行統計發現（表2），在考察的品種中，易感品種花育22號侵染率從0 d到第5天呈上升趨勢，第1天急劇升高達到60%，第3天達到90%。而抗侵染品種黔花生3號侵染率從0 d到第7天一直呈上升趨勢，第3天侵染率達27%，與花育22號相比，侵染速度較慢，整個接種時間內侵染率低于易產毒品種。

2.2.2 接種黃曲霉菌后芪化物含量的變化 對接種黃曲霉菌前后2個花生品種中4種芪化物合成規律和相關抗性酶變化規律進行檢測分析發現，花生在接種黃曲霉菌后，抗侵染品種黔花生3號在接種第3天芪化物總含量達到峰值，4種芪化物總量達到47.37 μg/g，為對照的54倍，而易感品種花育22號第3天才明顯增加，芪化物總量為5.49 μg/g，到第7天還處于上升的趨勢，即抗侵染品種接種黃曲霉菌后芪化物合成速度比易感品種快，抗侵染品種第3天達到峰值時，易感品種的芪化物含量低于抗侵染品種（圖3-A），變化趨勢與梁炫強等[16]研究結果相似。

2.2.3 接種黃曲霉菌后抗性相關酶活性的變化

PAL、POD和PPO是植物抗病代謝密切相關的3種酶，也是Res合成前體物質和代謝的關鍵酶[22]。與對照相比，接種后抗-感品種PAL活性均有所升高，抗性品種的PAL活性在接種后第1天達到了峰值，為對照的3.1倍，隨后開始下降；而易產毒品種在接種3 d后開始上升，第7天時還處于上升趨勢，PAL活性抗侵染品種提高比易感品種快（圖3-B）。POD和PPO的活性變化在抗侵染品種間相似，接種后活性都有明顯提高，并在第5天時達到峰值，分別為對照的26.8和9.3倍，隨后呈下降趨勢，并且抗侵染品種中這2種抗性酶活性都高于易感品種。在易感品種中，POD活性在第7天還處于上升趨勢，而PPO在第5天時達到峰值，隨后開始下降（圖3-C、D）。總體而言，在接種第3天時，抗侵染品種的3種酶活性都高于易感品種；除PPO外，抗侵染品種的PAL和POD活性高峰早于易感品種（圖3-B、C、D）。

2.3 花生品種接種黃曲霉菌后芪化物、病情指數、黃曲霉毒素的差異

芪化物的合成與抗黃曲霉菌產毒有一定的相關性，抗性品種較易感品種合成芪化物較快（圖3-A），在接種前3～5 d，白藜蘆醇含量也高于易感品種[16]，并且接種黃曲霉菌后3～5 d黃曲霉毒素含量處于上升期[23]。對16個花生品種的芪化物含量，病情指數和黃曲霉毒素B1、B2含量檢測發現，4種芪化物（Res、ε-viniferin、δ-viniferin和PS）總含量較高的花生品種為雜野3號、黔花生3號、628-35、貴陽小花生，含量分別為54.4、43.5、40.4、35.9 μg/g（圖4-A）；同時，這幾個品種的病情指數和黃曲霉毒素B1的含量相對較低，分別為0.20、0.11、0.24、0.30和451、415、597、700 ng/g（圖4-B、C）。不同品種黃曲霉毒素B2與芪化物含量變化相關性不顯著（圖4-D）。從圖4可以看出，大部分花生品種芪化物含量越高，其病情指數和黃曲霉毒素B1 含量就越低。

2.4 花生品種間芪化物與病情指數、黃曲霉毒素的相關性

對不同品種芪化物含量與種子病情指數、黃曲霉毒素B1、B2及黃曲霉毒素含量之和（B1、B2）的相關性進行了分析，結果顯示（表3）：芪化物含量與病情指數、黃曲霉毒素B1和黃曲霉毒素之和呈極顯著負相關，相關系數（r）分別為：、-0.789、-0.851、-0.850；芪化物含量與黃曲霉毒素B2之間為負相關，但相關性不顯著。不同品種的黃曲霉毒素B1和黃曲霉毒素之和相關性達到顯著，相關系數（r）為0.999，證明種子接種黃曲霉菌后，黃曲霉毒素B1是接種后黃曲霉毒素的主要成分。不同品種表現的病情指數與黃曲霉毒素B1和2種黃曲霉毒素總含量呈極顯著正相關，相關系數為分別為0.783、0.766，表明病情指數可作為表觀的抗產毒指標。不同的花生品種黃曲霉毒素B2的含量變化較為穩定，為考慮總的抗產毒性，以黃曲霉毒素之和篩選抗產毒品種更為合理。

3 討論與結論

花生接種黃曲霉菌后啟動了很多抗病因子可以抵抗黃曲霉菌的進一步侵染。Res是植物次生代謝產物，通過苯丙氨酸代謝途徑合成，PAL是其合成前體物質的關鍵酶和限速酶[24]，而Res合成的同時，也會在糖苷轉移酶（Glycosyltransferase）、甲氧基轉移酶（Res-O-Methyltransferase），POD或PPO等作用下代謝成其他的芪化物[2，5，25]。因此，白藜蘆醇的代謝產物和相關代謝酶活性也是衡量抗病的重要因子。

對接種黃曲霉菌前后抗-感花生品種中4種芪化物合成規律和相關抗性酶活性變化規律分析發現，接種后抗產毒品種黔花生3號芪化物合成高峰（第3天）早于易產毒品種花育22號，即抗性品種受黃曲霉菌侵染后芪化物合成量提高比易感品種早（圖3-A）。在接種第5天時易產毒品種的芪化物含量才高于抗產毒品種。梁炫強等[16]研究表明，花生種子受病原菌侵染后，Res的合成速率與品種的抗-感病性有關，抗產毒品種合成白藜蘆醇的高峰也早于易產毒品種，雖然本研究接種的黃曲霉菌孢子濃度與之不同，但變化規律實驗結果卻相似。前期實驗表明，在規定的接種時間內（第3天）Res或相關的代謝產物與侵染率呈負相關，在考察的品種中Res、ε-viniferin、δ-viniferin和PS 4種芪化物總量占所檢測芪化物總含量的75.0%以上，芪化物含量之和與侵染率的相關系數（r）達到了-0.812。同時，同一品種在不同種植地區對黃曲霉菌的抗病性差異較大[18]。因此，為了減少環境等因素的影響，花生種子需要在同一地區種植后，以接種第3天時4種芪化物之和為考核指標，來評價不同花生品種的抗產毒能力。

接種黃曲霉菌后，抗-感花生品種間PAL活性存在明顯差異。與對照相比，PAL酶活性都有明顯的提高；抗性品種PAL活性在接種1 d達到峰值，而易產毒品種則在接種3 d才明顯升高，第5天時才達到抗性品種的酶活性；并且PAL酶作為合成白藜蘆醇前體物質的關鍵酶，抗性品種活性高峰都出現在芪化物合成高峰之前，說明PAL活性高峰出現的早晚與花生種子接種黃曲霉菌后的抗性表現有一定關系。田立榮研究發現[23]，抗-感花生種子接種黃曲霉菌后出現不同的酶活性高峰，與對照相比都顯著提高，抗性材料明顯高于感病材料，抗產毒品種的活性高峰出現在接種第2天，造成與本研究不同結果的原因，可能是所采用的花生品種不同、病原菌株系不同從而導致寄主-病原菌之間相互作用不同。

POD和PPO屬于氧化酶系統，主要參與木質素的聚合和酚類的氧化，從而形成抵御病原菌侵入的機械屏障[26]。研究表明[5，8，9]，在POD和PPO的作用下，白藜蘆醇可氧化合成白藜蘆醇二聚體（ε-viniferin，δ-viniferin），這2種二聚體可作為篩選葡萄抗病品種的化學指標。實驗表明，抗產毒品種的POD和PPO活性在接種7天內前都高于易產毒品種。在第5天酶活性達到峰值時，芪化物總量顯著降低，可能是由于木質素等酚類物質的合成也消耗了部分酶（圖3-C、D），或許芪化物作為植物抗毒素，在受到逆境時本身會呈現先升高后降低的變化規律[27-28]。花生接種黃曲霉菌后，在芪化物含量或抗性酶活性未顯著增加之前，易產毒品種的侵染率就達到了60%，而抗產毒品種的侵染率一直較低（表2），研究者認為，接種后抗產毒材料表達的速度快、強度高，酶活性顯著上升，可迅速合成足夠量的次生代謝物質，起到抑制黃曲霉菌生長或產毒的作用，并推測抗產毒品種在受到黃曲霉菌侵染后種子本身充分啟動了苯丙烷代謝途徑；而易產毒品種各種防御酶受誘導發揮作用的速度和強度不如抗產毒品種，因此不能及時產生足夠量的抗性物質，從而不能及時或不足以抵抗真菌的侵染和產毒[23]。芪化物是抗癌和抗氧化等多方面的有益因子，進一步探索花生中芪化物的合成及代謝規律，對于合理調控和提高花生中芪化物的含量，增強花生的抗產毒能力具有重要的作用。

實驗過程中發現了4個芪化物含量高、病情指數低、黃曲霉毒素含量也相對較低的花生品種，然而進行花生抗黃曲霉菌產毒的品種資源篩選時，其他的品質性狀也很重要。有研究者對種子大小，出仁率，蛋白含量，含油量，油酸等與抗黃曲霉菌產毒進行了相關性研究，發現高含油量、高蛋白質含量和高油酸資源對黃曲霉菌侵染和產毒的抗性較差；相關分析表明，不同花生品種種子大小、油酸含量和含油量與抗黃曲霉菌產毒呈顯著負相關[20，29]。因此，要得到芪化物含量較高、其他品質性狀較好的花生品種，有待筆者進一步研究探索。

花生種子接種黃曲霉菌后，抗-感品種的芪化物合成速度有明顯差異，抗產毒芪化物含量高峰早于易產毒品種；在接種黃曲霉菌第3天，抗產毒品種芪化物含量和相關抗性酶（PAL、POD、PPO）活性都高于易產毒品種；不同花生品種接種黃曲霉菌3天時，芪化物含量與病情指數、黃曲霉毒素含量呈極顯著負相關；病情指數可作為篩選抗侵染和抗產毒品種的表觀指標。因此，芪化物含量可作為篩選花生種質抗黃曲霉菌產毒的重要參數，但要得到芪化物含量較高、其他品質性狀較好的花生品種還有待進一步研究探索。

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