7株拮抗菌的鑒定及其對香蕉炭疽病的防治作用

付崗　葉云峰　吳永官　杜嬋娟　晏衛紅　潘連富

摘 要 為了收集利用香蕉炭疽病的生防菌資源和評價拮抗菌的防病能力，通過培養性狀與形態特征觀察、生理生化反應和16S rRNA序列特征分析等方法對篩選到的7株拮抗菌進行鑒定，并對其防病作用進行了初步測試。結果表明：菌株Bb7802、Bb7304、Bb7202、Bb7108、Bb7004和Bb5911為短短芽孢桿菌，菌株Bc6301為蠟狀芽孢桿菌。人工接種結果表明，菌株Bc6301對香蕉炭疽病的防效最高，為45.94%，其余6株拮抗菌的防效在22.35%～43.29%。

關鍵詞 芭蕉炭疽菌；短短芽孢桿菌；蠟狀芽孢桿菌

中圖分類號 S436.67 文獻標識碼 A

香蕉炭疽病由芭蕉炭疽菌[Colletotrichum musae（Berk. & Curt.）Arx]引起，是香蕉儲運過程中發生最為嚴重的病害之一[1]。由于重視程度不同和防治手段差異，由香蕉炭疽病導致的損失在20%～40%，嚴重時可達80%以上[2-3]。目前香蕉炭疽病的防治主要還是依靠化學藥劑，異菌脲、咪鮮胺、噻菌靈等生產上最常用的化學殺菌劑，由此帶來的農藥殘留問題已經成為中國香蕉產業發展的重要限制因素之一[4-5]。另外，由于長期大量使用化學農藥促使病原菌產生抗藥性。因此，人們越來越重視尋求針對香蕉炭疽病的非化學防治途徑。

由于香蕉在采后儲運期間所處的環境條件相對較為穩定，這給拮抗微生物的利用提供了有利條件。許多不同種類的拮抗菌被篩選用于防治香蕉炭疽病，其中以芽孢桿菌類（Bacillus sp.）細菌較為常見[6]。枯草芽孢桿菌（B. subtillis）是最常見的香蕉炭疽病拮抗菌[7-9]。此外，也有利用解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）等防治該病的報道[10]。雖然研究者們已篩選到相當數量的拮抗微生物，但目前這些菌株尚未能應用于生產。作者在前期研究中從廣西南寧不同作物根圍獲得的997株分離物中篩選到7株對香蕉炭疽病菌有較強抑菌作用的拮抗菌株，本文通過形態特征觀察、生理生化測試結合16S rRNA序列特征分析對這7株拮抗菌進行鑒定，并評價其對香蕉炭疽病的防治作用，旨在為香蕉炭疽病的生物防治提供新的菌種資源和應用基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：香蕉炭疽病菌（Colletotrichum musae）Cm1和7株拮抗菌Bb7802、Bb7304、Bb7202、Bb7108、Bb7004、Bb5911和Bc6301菌株均由廣西農業科學院微生物研究所生物防治研究室提供。

供試香蕉：品種威廉斯（Musa AAA Cavendish var.Williams），采自廣西隆安縣丁當鎮香蕉園，采收前2個月內未噴施殺菌劑。

培養基：PDA培養基[5]和NA培養基[7]，分別用于培養香蕉炭疽病菌和拮抗菌。

分子生物學試劑：細菌基因組DNA提取試劑盒購自杭州博日科技有限公司；Taq酶和dNTP購自北京百川開泰生物科技有限公司生產；引物F27和R1492由上海生工生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 菌株的形態和生理生化特征 參照《常見細菌系統鑒定手冊》、《一般細菌常用鑒定方法》和《伯杰細菌鑒定手冊》觀察各菌株的培養形態、性狀、鞭毛和芽孢、革蘭氏染色，測定菌株的生理生化特征，觀察不同pH值、溫度條件下菌株的生長狀況及耐鹽性[11-13]。

1.2.2 拮抗菌的16S rRNA序列分析 參照說明書用細菌基因組DNA提取試劑盒提取各拮抗菌株的DNA。采用細菌16S rRNA通用擴增引物Primer F27（5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′）和Primer R1492（5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進行PCR擴增。PCR反應體系和PCR反應程序參照Fu等[7]的研究方法。

擴增產物電泳檢測后送上海生工生物公司，用引物Primer F27和R1492進行測序。測得的序列與GenBank數據庫中已有序列進行BLAST同源性比對，并利用Mega 6.06軟件采用鄰接法（N-J）構建系統發育樹。

1.2.3 拮抗菌對香蕉炭疽病的防治效果 7株拮抗菌分別接種于NA液體培養基中，28 ℃下 150 r/min搖床培養3 d，得到OD625=0.8的菌體發酵液。制備香蕉炭疽病菌孢子液濃度為104個/mL，備用。

田間采收八成熟的蕉果，去除傷病蕉果，將自然梳分成單個蕉指，抹去花器，洗凈晾干。蕉果在拮抗菌發酵液的10倍稀釋液中浸泡10 min后取出，室溫下晾干，以清水為對照。24 h后用Cm1孢子懸浮液對蕉果進行噴霧接種。再次晾干后，用厚度0.04 mm的聚乙烯袋密封包裝，然后放入紙箱，于27 ℃下，RH 78%放置貯藏。每個拮抗菌株3個重復，每重復8個蕉果。

共進行2次病情調查，實驗香蕉始發病時進行第1次調查，香蕉完全成熟后進行第2次調查；參照Fu等的標準進行病情分級[7]。拮抗菌對香蕉炭疽病的防治效果的計算公式為：病情指數=[100×∑（各級病果數×相對級數值）]/（調查總果數×9）；防治效果/%=100×（對照區病情指數-處理區病情指數）/對照區病情指數。

1.2.4 拮抗菌株Bc6301對香蕉炭疽病菌的抑制作用

按1.2.3方法制備Bc6301的菌體發酵液和香蕉炭疽病菌Cm1菌株的孢子液。將拮抗菌發酵液通過0.22 μm細菌過濾器獲得無菌濾液，與Cm1菌株孢子液等量混合后，置凹玻片28 ℃共培養。以等量無菌水與Cm1孢子液混合為對照，24 h后鏡檢病菌孢子生長萌發情況。每次隨機選取3個視野，計數視野內可見的所有孢子，芽管長度大于孢子長度1/2的計為孢子萌發。每處理均設3次重復。

1.3 數據分析

所有實驗數據均采用SAS9.0軟件進行分析，采用Duncan's新復極差法比較各處理間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 菌株的形態特征

拮抗菌在NA平板上培養16 h后，陸續出現單菌落。菌株Bb7802、Bb7304、Bb7202、Bb7108、Bb7004和Bb5911的形態特征較為一致，單菌落為圓形、有光澤、不透明，中間隆起，邊緣整齊（圖1-A）。電子顯微鏡下可見菌體呈短桿狀，產芽孢，具周生鞭毛（圖1-B）。

菌株Bc6301的單菌落乳白色、粘稠厚重、半透明、濕潤光亮，表面似毛玻璃或蠟狀（圖1-C）。菌體呈桿狀，鞭毛周生較稀疏（圖1-D）。

2.2 菌株的生理生化特征

7株拮抗菌的生理生化反應測試結果見表1。Bb7802、Bb7304、Bb7202、Bb7108、Bb7004和Bb5911等6菌株的測試反應結果類似，其中12項生理生化測試及其生長溫度和pH值測試結果完全一致，并與細菌分類學專著[11-13]中對短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）的描述相符。B. brevis的硝酸鹽還原、檸檬酸鹽利用和2% NaCl生長這3項測試反應在《常見細菌系統鑒定手冊》中的描述為結果可變。表1的結果顯示，以上6株拮抗菌之間在這3項反應上確有細微差異。

與前述6株拮抗菌相比，菌株Bc6301的生理生化反應結果差異較大。如，在V-P反應、硫化氫產生、淀粉水解、卵磷脂酶、厭氧生長等方面都呈現不同反應。根據各菌株的生理生化反應結合其形態特征，參照細菌分類學專著[11-13]，可初步確定菌株Bc6301為蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）。

2.3 菌株的16S rRNA序列特征

經基因組DNA提取，對7株拮抗菌的16S rRNA區段進行PCR擴增，均得到大小約1.5 kb的擴增產物。7份PCR產物經測序分別得到1 402～1 459 bp的堿基序列，所有序列均上傳至GenBank數據庫，并獲得了各自的登錄號，結果如表2所示。各序列與GenBank中已有序列的Blast比對結果顯示，菌株Bc6301與蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）的16S rRNA序列的同源性最高，達100%；其余6菌株的相應序列均與短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）的同源性最高，為99%。

以Agrobacterium rhizogenes（FJ527681）為外群，構建了菌株Bb7802、Bb7304、Bb7202、Bb7108、Bb7004、Bb5911與相關24個細菌菌株的系統發育樹，這6株拮抗菌與其它4株短短芽孢桿菌（EU771078、GQ375794、EF488102、AY591911）共同聚集在同一個小的分支內，包括這個分支在內的所有短芽孢桿菌屬的菌株均處于同一個大的分支中。而芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）的菌株（EU257435）處于距離較遠的分支。說明這6株拮抗菌與短芽孢桿菌屬的短短芽孢桿菌的親緣關系最近（圖2）。

以Xanthomonas cynarae（AF208315）為外群，構建的菌株Bc6301與GenBank數據庫中21個相關菌株的系統發育樹如圖3。從圖中可以看出，菌株Bc6301與所有芽孢桿菌屬的細菌處于同一個大的分支，并與3株蠟狀芽孢桿菌（HM026606、FJ908707、GU812900）處于同一個較小分支內，顯示菌株Bc6301與蠟狀芽孢桿菌的親緣關系最近。

2.4 拮抗菌對香蕉炭疽病的防治效果

7株拮抗菌對香蕉炭疽病的防治效果見表3。香蕉貯藏16 d開始發病，各處理病情指數在15.42～26.78；從防效看，蠟狀芽孢桿菌Bc6301的防效最高，為71.24%，6株短短芽孢桿菌的防效在50.06%～65.74%。貯藏至19 d香蕉完全成熟，各處理區的病情指數均有增長，防效均有所降低，但Bc6301菌株的防效（68.24%）仍明顯高與其它菌株。6株短短芽孢桿菌防效最高者為菌株Bb7802和Bb7304，分別為63.72%和61.59%。

2.5 拮抗菌Bc6301對香蕉炭疽病菌孢子萌發的抑制作用

鏡檢可見菌株Bc6301對香蕉炭疽病菌的孢子萌發有明顯的抑制作用。清水對照的病菌孢子萌發率可達84.4%，而經拮抗菌發酵液處理的病菌孢子萌發率僅為36.8%，并且孢子芽管較短。但未觀察到孢子畸形或原生質泄露現象（圖4）。

3 討論與結論

通過對各菌株的形態觀察和生理生化指標的測定，參照分類學專著并結合菌株16S rRNA序列特征的分析，將6株拮抗菌Bb7802、Bb7304、Bb7202、Bb7108、Bb7004和Bb5911鑒定為短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis），將菌株Bc6301鑒定為蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）。

短短芽孢桿菌作為其它植物病害生防菌的研究國內外已有相關報道，其防治對象有煙草青枯病[14]、柑橘炭疽病[15]、萵苣菌核病[16]、草莓灰霉病[17]、番茄枯萎病[18]、黃瓜枯萎病[19]、瓜類枯萎病[20]、蔬菜猝倒病[21]和棉花枯黃萎病[22]等，但至今尚未見利用短短芽孢桿菌防治香蕉炭疽病的報道。

蠟狀芽孢桿菌作為植物病害生防菌已報道的防治對象有棉花黃萎病[23]、黃瓜枯萎病[24]、草莓白粉病[25]、小麥全蝕病[26]、植物青枯病[27]等。但未見蠟狀芽孢桿菌用于防治香蕉炭疽病。本研究進一步擴展了短短芽孢桿菌和蠟狀芽孢桿菌作為生防菌的抗病譜，也進一步擴充了香蕉炭疽病生防菌的資源庫，為下一步香蕉炭疽病的生物防治提供了菌種材料。

對香蕉炭疽病的防效測試結果表明，香蕉貯藏16 d，7株拮抗菌的最高防效為71.24%，至蕉果完全成熟時，仍有3株拮抗菌的防效在61.59%以上。本研究中拮抗菌的培養是按照普通細菌的培養方式進行，而實際上，若針對某一特定的拮抗菌株采用與之相適應的最佳培養條件，并輔以合適的助劑，其防病效果還將有所提升。也就是說這些拮抗菌仍存在較大的生防潛能有待開發，這也是今后需要進一步研究的內容。

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