海南省象耳豆根結線蟲的鑒定研究

龍海波　孫艷芳　白成　郭建榮　曾凡云

摘 要 象耳豆根結線蟲寄主范圍廣、致病力強以及能在攜帶Mi抗性基因的作物上寄生繁殖，是熱區最具危害性的病原根結線蟲種類之一。應用比較形態學，結合mtDNA序列分析、IGS序列分析和進化發育樹等分子生物學方法對海南省18個市縣的根結線蟲進行鑒定，確定象耳豆根結線蟲在蔬菜、番石榴、哈密瓜和棗樹等作物上廣泛發生為害，其中棗樹為首次發現的象耳豆根結線蟲新寄主。研究結果表明，象耳豆根結線蟲已成為海南省蔬菜作物上重要的病原根結線蟲種，并有進一步擴散加重為害的趨勢。

關鍵詞 象耳豆根結線蟲；鑒定；會陰花紋；線粒體DNA；進化分析

中圖分類號 S436.3 文獻標識碼A

象耳豆根結線蟲（Meloidogyne enterolobii）是近幾年引起廣泛關注和重視的一個熱帶根結線蟲新種，在亞洲、非洲、歐洲以及北美熱帶和亞熱帶地區均有發生分布[1]。該線蟲具有極其廣泛的寄主范圍，包括豆科、茄科、葫蘆科中的多種蔬菜，以及大豆、玉米、棉花、煙草、番石榴和荔枝等重要糧食和經濟作物[2-3]。與南方根結線蟲（M. incognita）和爪哇根結線蟲（M. javanica）等主要根結線蟲種類不同的是，象耳豆根結線蟲能夠克服Mi、N和Rk等抗線蟲基因介導的抗性反應，在抗性番茄、辣椒和豇豆等蔬菜上寄生繁殖，造成的產量損失可達到65%以上[1，4]。此外，象耳豆根結線蟲被證實與在歐洲和美國廣泛發生的瑪雅古根結線蟲（M. mayaguensis）為同種異名[5]。目前，象耳豆根結線蟲已被國際上公認為最具危害性的植物病原線蟲之一，歐洲和地中海植物保護組織將其列入了A2警報名錄[6]。

象耳豆根結線蟲最早在海南儋州象耳豆樹上發現，自1983年首次報道后的20多年時間內一直被認為是少數種或次要種而受到長期忽視[7]。近年來，陸續有報道象耳豆根結線蟲在海南儋州、三亞、瓊海、澄邁、陵水等市縣的蔬菜和水果上發生為害[8-10]。劉昊等[8]對儋州、瓊海和澄邁三地的番石榴上分離的9個根結線蟲種群進行鑒定，結果表明全部為象耳豆根結線蟲。卓侃等[9]在海南海口和定安的木豆上分離到象耳豆根結線蟲，并且首次在廣東發現該線蟲為害南瓜和辣椒。隨后，海南文昌、陵水、東方等地的多種瓜果蔬菜和沉香、丁香上均發現象耳豆根結線蟲寄生為害[10-11]。越來越多的研究結果表明，象耳豆根結線蟲在海南島快速擴散蔓延，并有可能成為海南當地作物尤其是瓜果蔬菜上的重要根結線蟲種類。

海南省地處熱帶，根結線蟲病害發生嚴重，且存在的根結線蟲種類繁多。對根結線蟲的鑒定，傳統的方法主要是依據會陰花紋的形態特征，但根結線蟲不同種群之間具有較大變異[12]。此外，熱帶根結線蟲種類尤其一些少數種如西班牙根結線蟲（M. hispanica）、埃塞俄比亞根結線蟲（M. ethiopica）在會陰花紋特征上往往與常見種具有高度的相似性，很難區分而容易導致鑒定結果不夠準確[13-14]。例如，象耳豆根結線蟲會陰花紋部分形態與南方根結線蟲相似，曾被錯誤鑒定為南方根結線蟲[15]。鑒于象耳豆根結線蟲毒性強、危害大的特點，2011～2014年筆者對采自海南省18個市縣的根結線蟲群體進行分離，并利用比較形態學與分子生物學相結合的方法對象耳豆根結線蟲進行鑒定，旨在明確象耳豆根結線蟲是否已擴散至海南省全島分布，同時也為準確鑒定及防治該線蟲提供依據和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

2011～2014年在海南省18個市縣采集具有明顯“根結”癥狀的作物病根，帶回實驗室內編號后分離根結線蟲。所獲病根樣品用清水輕輕沖洗干凈，經1%食用色素亮藍染色后在解剖鏡下挑取單卵囊，并接種于感病番茄（cv. 特級大明星）上進行種群純化培養和活體保存。

1.2 方法

1.2.1 線蟲形態學觀察與測定 取接種單卵囊40 d左右的病土和番茄病根，采用淺盆法從病土中分離獲得根結線蟲二齡幼蟲，雌蟲用挑針和鑷子從病根組織中直接分離獲得。參照劉維志[16]所描述的方法進行線蟲的殺死、固定以及制作臨時玻片。顯微鏡下進行觀察、測量并記錄二齡幼蟲體長、最大體寬、DGO、口針長度、尾長等形態指標，每個種群觀察樣本數為20頭幼蟲。參照張紹升[17]所描述的方法制作雌蟲會陰花紋，在顯微鏡下觀察拍照保存。

1.2.2 線蟲DNA提取 參照萬新龍[18]所描述的方法，略有修改。顯微鏡下挑取單頭二齡幼蟲置于含有10 μL滅菌雙蒸水的PCR管中，點動離心后放入液氮中速凍30 s，隨后37 ℃水浴30 s進行蟲體凍融破碎，重復3次。加入8 μL 10×PCR Buffer（TaKaRa），2 μL蛋白酶K（20 mg/mL），輕彈混勻后PCR儀中65 ℃溫育90 min，接著95 ℃保溫10 min。樣品于13 000 r/min離心1 min，取其上清液用于PCR擴增或者于-20 ℃保存備用。

1.2.3 mtDNA序列擴增 利用Powers等[19]設計的上下游引物對 #C2F3（GGTCAATGTTCAGAAATTT

GTGG）和#1108（TACCTTTGACCAATCACGCT）擴增根結線蟲線粒體DNA（mtDNA）coⅡ（細胞色素氧化酶亞基Ⅱ）與lrRNA基因間序列。PCR反應使用Ex Taq酶PCR擴增試劑盒（TaKaRa），總體系為50 μL，其中10×PCR Buffer 5 μL，dNTPs 4 μL，Mg2+ 3 μL，上下游引物各1 μL，Ex Taq酶0.25 μL，DNA模板5 μL，滅菌雙蒸水30.75 μL。PCR擴增褪火溫度為53 ℃，共35個循環。PCR產物經1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測觀察，并對目的條帶進行切膠回收、連接、轉化，最后挑取陽性克隆送華大基因公司測序。

1.2.4 rDNA- IGS2序列擴增 利用Long等[20]設計的象耳豆根結線蟲特異引物對MeF（AACTTTTGT

GAAAGTGCCGCTG）和MeR（TCAGTTCAGGCAGGA

TCAACC）擴增rDNA的基因間隔區IGS2。PCR反應使用Ex Taq酶 PCR 擴增試劑盒（TaKaRa），總體系為25 μL，其中10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs 2 μL，Mg2+ 1.5 μL，上下游引物各1 μL，Ex Taq酶0.25 μL，DNA模板5 μL，滅菌雙蒸水11.75 μL。PCR擴增褪火溫度為54 ℃，共35個循環。PCR產物經1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測觀察。

1.2.5 序列分析與系統發育樹構建 所獲序列利用BlastN程序在NCBI網站（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）上進行序列同源性搜索比對分析；基于mtDNA序列的系統發育樹使用MEGA6.0軟件的最大似然法進行構建[21]，選取松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）為外群序列（outgroup），建樹步長重復數為1 000次（bootstrap replicates=1 000）。

2 結果與分析

通過對采自海南省各市縣根結線蟲樣本純化種群的形態學觀察和分子鑒定，確定在海南省?？?、三亞、澄邁等15市縣均有象耳豆根結線蟲的發生，寄主作物包括多種蔬菜以及胡椒、番石榴、棗樹等（表1）。

2.1 形態學特征

顯微鏡下對二齡幼蟲和雌蟲會陰花紋進行觀察，表1所列的各種群具有相似的形態特征。二齡幼蟲線形，體環小而清晰；頭冠明顯，側唇大呈三角形；口針纖細，基部球清楚、大、圓，與口針基桿分界明顯；中食道球呈橢圓形，直腸膨大；透明尾區界限明顯，尾尖鈍圓（圖1-a、b）。具體測量值為（n=20）：體長（L）為392～453 μm，體寬（W）為15.3～16.7 μm，口針長（ST）為10.5～12.8 μm，背食道腺開口到口針基球附近的距離（DGO）為3.9～5.0 μm，尾長（Tail）為47.4～60.1 μm。

雌蟲會陰花紋種群內個體之間存在輕微變異，但種群之間變異程度相近。主要特征表現為花紋呈橢圓形或近圓形，背弓通常較高，線紋緊密且細，呈波浪形（圖1-c、d）。大多數會陰花紋無側線，少數具1條或2條不明顯的側線。

2.2 分子鑒定

應用根結線蟲通用引物#C2F3和#1108擴增表1中38個種群的mtDNA coⅡ與lrRNA 基因間序列，均獲得了大小約700 bp的電泳條帶（圖2）。通過對隨機選取的HKC2、WCT2、CJC1、DZL1、WNC1、LGL1、CMY2、TCX1、LSS1和SYH1等10個種群mtDNA擴增產物進行測序，片段長度均為705 bp，且各種群之間的序列一致性為100%。BlastN同源性搜索比對顯示SYH1種群與NCBI數據庫中的瑪雅古根結線蟲（M. mayaguensis）（與M. enterolobii同種異名）一致性為100%（AY446969，E-value=0）。

應用象耳豆根結線蟲特異引物對MeF和MeR擴增表1各種群的IGS2序列，均獲得長度約300 bp的特異條帶，對照南方根結線蟲無擴增條帶（圖3）。

2.3 基于mtDNA序列的進化分析

通過對GenBank數據庫中注冊的各根結線蟲種群的mtDNA序列進行聚類分析，進化樹圖結果顯示SYH1與數據庫中的象耳豆根結線蟲和瑪雅古根結線蟲序列一致，其步長值（bootstrap value）達到100%（圖4）。同時，進化樹顯示象耳豆根結線蟲與南方根結線蟲（M. incognita）、爪哇根結線蟲（M. javanica）、花生根結線蟲（M. arenaria）等熱帶根結線蟲種聚為一個較大分支，并且具有高置信度（bootstrap value=84%）。

3 討論與結論

植物病原線蟲種類的準確鑒定是治理線蟲病害的基礎，通過鑒定，依據線蟲發生種類的為害特點和生物學特性，從而可制定出相應的防治策略。本研究結果二齡幼蟲的測量值和雌蟲會陰花紋的形態特征與yang等[7]首次描述的象耳豆根結線蟲的二齡幼蟲觀測值和雌蟲會陰花紋類型相符合。而根據mtDNA擴增片段的大小和歸類分析比對更是將象耳豆根結線蟲（～700 bp）與南方根結線蟲（～1 700 bp）、爪哇根結線蟲（～1 700 bp）和花生根結線蟲（～500 bp）區分的一種快速、簡單有效的方法[19]。同時，本研究所擴增的象耳豆根結線蟲IGS2特異序列大小與Long等[20]所描述的一致。因此，以上的形態學特征和DNA序列結果表明了本研究耳豆根結線蟲鑒定結果的準確性。

本輪鑒定研究在海南?？凇①僦?、三亞等15個市縣的蔬菜等作物上鑒定出象耳豆根結線蟲的寄生為害，其中棗樹、胡椒、紅薯、胡椒和哈密瓜為首次在海南發現的新寄主。結合有研究報道象耳豆根結線蟲在定安和瓊中的蔬菜上亦有發生[10，22]，至此，海南省18個市縣除五指山市未見報道以外，其余17個市縣已均有象耳豆根結線蟲的發生分布。值得注意的是，賈本凱等[22]在海南省茄果類蔬菜根結線蟲的調查鑒定中，14個根結線蟲種群中有6個為象耳豆根結線蟲，還有2個為象耳豆根結線蟲和南方根結線蟲的混合侵染種群。黃偉明等[11]對海南5個市縣的葫蘆科蔬菜上根結線蟲種群進行鑒定，結果發現10個純化系中，8個為象耳豆根結線蟲。越來越多的研究表明，象耳豆根結線蟲已成為海南省蔬菜作物上一個主要的根結線蟲病原種，而且其快速擴散的趨勢很有可能取代南方根結線蟲成為海南當地的優勢種。

目前，我國華南熱區除海南省以外，廣東、廣西和福建的一些市縣也先后報道有象耳豆根結線蟲的發生[9，23-24]，而隨著全球氣候變暖以及溫室農業的發展，象耳豆根結線蟲病害更有向溫帶地區蔓延的趨勢。然而，象耳豆根結線蟲廣泛的寄主范圍、高度的侵染致病能力以及一些高毒化學殺線劑的禁用等現狀，使傳統的防治措施面臨著嚴峻的挑戰。因此，提高農戶防治意識、加強象耳豆根結線蟲的早期鑒定研究以及建立綠色綜合防控技術體系是當前保障海南熱區農業可持續發展的迫切需求。

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