香蕉多酚氧化酶成熟蛋白的原核表達

陳嬌　孫長君　楊昭　王朝政　李奕星　李芬芳　袁德保　譚琳　仇厚援　陳文學　金志強

摘 要 筆者所在課題組從巴西香蕉中分離到1個PPO基因全長，并進行了原核表達，但結果未表達出目的蛋白。鑒于上述情況，筆者對香蕉PPO全蛋白進行轉移肽分析，結果發現其N端含有轉移肽，長度為47個氨基酸。切除轉移肽并進行香蕉PPO成熟蛋白原核表達，SDS-PAGE電泳檢測結果表明，在62 ku處有一條特異的蛋白條帶，與預測大小相符；并且進行質譜分析，結果確定重組表達蛋白為香蕉PPO，初步說明轉移肽對香蕉PPO體外表達的影響，為進一步研究香蕉PPO功能及在香蕉褐變生理和調控機制中的作用提供理論基礎。

關鍵詞 香蕉；多酚氧化酶；轉移肽；成熟蛋白；原核表達

中圖分類號 S668.1 文獻標識碼 A

Prokaryotic Expression of Polyphenol Oxidase Mature

Protein from Banana（Musa acuminate）

CHEN Jiao1， SUN Changjun1*， YANG Zhao2， WANG Chaozheng1， LI Yixing1， LI Fenfang1，

YUAN Debao1**， TAN Lin1**， CHOU Houyuan2， CHEN Wenxue2， JIN Zhiqiang1

1 Haikou Experimental Station， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Hainan Key

Laboratory of Banana Genetic Improvement， Haikou， Hainan 570102， China

2 Institute of Food， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract A full-length PPO gene was isolated from banana， and the prokaryotic expression of this full-length gene was not succeeded. A 47 amino acids length transit peptide in its N-terminus was predicted by further amino acid sequence analysis. Prokaryotic expression of mature PPO protein without the transit peptide was performed. SDS-PAGE electrophoresis results showed a 62 ku specific protein bands with the expected size， and mass spectrometry analysis results showed that the recombinant protein was banana PPO. The results indicated that the transfer peptide may affect banana PPO expression in vitro， and lay some theory foundation to study the functions of banana PPO and its role in banana browning physiology and regulatory mechanisms.

Key words Banana；Polyphenol oxidase；Transit peptide；Mature protein；Prokaryotic expression

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.12.015

香蕉（Musa acuminate）是世界最重要的水果之一，同時在一些經濟不發達的國家也作為一種重要糧食作物[1-2]。然而香蕉自身非常容易褐變，褐變不僅影響了香蕉的外觀品質，而且破壞了香蕉的質地結構和風味物質，導致其營養價值成分降低，從而嚴重限制香蕉加工產業的發展。人研究結果表明，多酚氧化酶引起的酶促褐變是香蕉褐變的主要原因[3-4]。多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）是一類廣泛存在于動植物、真菌及細菌中的含銅質體金屬酶[5-6]。廣義上PPO可分為3大類：兒茶酚氧化酶、漆酶和酪氨酸酶[7]。PPO在生物體內色素合成及酶促褐變過程中起關鍵的作用[5，8-9]。因此，對香蕉PPO及其基因的研究具有巨大的理論和應用價值[10]。

目前，對香蕉PPO的研究主要集中在酶學特性、分離純化、活性抑制等方面，對香蕉PPO基因的研究仍非常有限，主要是關于香蕉PPO基因部分序列擴增及香蕉果皮褐變與PPO基因表達量關系的研究[11-15]，但體外表達香蕉PPO基因的研究至今未見報道。基因的體外表達對研究其所編碼蛋白質的結構、功能及其實際應用都十分重要[16]。根據外源基因表達的宿主不同，可將表達系統大致分為2類：原核和真核表達系統。原核表達系統是最常用的表達系統，也是最經濟實惠目前研究最清楚的表達系統。根據現有大量研究結果表明，大部分植物PPO定位于質體膜上，需要經翻譯后加工才能獲得酶活。首先，含有轉移肽（導肽）的前體PPO在核基因的控制下，在細胞質中合成，然后轉移肽引導前體PPO進入葉綠體，而在PPO被引導進入質體后導肽則被切除。最后，PPO再經過一定的折疊等翻譯后加工，而成為獲得活性的成熟PPO[17]。

為了進一步深入研究香蕉PPO的結構與功能，并明確其與香蕉果皮褐變的關系。本研究將對未能成功表達的香蕉PPO全蛋白進行轉移肽分析、切除，然后再進行香蕉成熟PPO原核表達，以期能夠成功獲得香蕉PPO成熟蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料

香蕉PPO基因全長由本實驗室自主克隆獲得且已在GenBank登錄（登錄號：KF900300.1），并且已構建香蕉PPO全蛋白原核表達載體pQE80L - MaPPO1（含轉移肽）。載體質粒pQE80L、感受態細胞E. coli DH5α由中國熱帶農業科學院海口實驗站保存。宿主菌 E. coli M15為暨南大學姚占娟博士惠贈。Taq DNA聚合酶、pMD19-T、KpnⅠ、HindⅢ限制性內切酶、T4 DNA連接酶、膠回收試劑盒、DNA marker購自TaKaRa 公司；Blue Plus Protein Marker（DM101）購自北京全式金生物技術有限公司；Folin-酚試劑（SK5031）購自生工生物工程（上海）有限公司；亞甲基雙丙烯酰胺、丙烯酰胺購自BBI公司；瓊脂糖金屬螯合介質購自國家生化工程技術研究中心；其它常規試劑均為國產分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 香蕉PPO全蛋白轉移肽位置的分析 利用CBS網站上的TargetP 1.1 Server軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/psort）和ChloroP 1.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/）在線預測香蕉PPO全蛋白導肽位點和導肽形式，分析并確定香蕉 PPO 轉移肽的位置，為成熟蛋白原核表達載體的構建提供基礎。

1.2.2 香蕉PPO成熟蛋白基因克隆及原核表達載體的構建 通過軟件ChloroP 1.1 Server在線預測，確定轉移肽的位置，并將切除轉移肽后的蛋白命名為MaPPO533，對應的基因命名為MaPPO533。根據 MaPPO533基因全長cDNA序列及pQE80L載體多克隆位點分析，在上下游引物上引入KpnⅠ和 HindⅢ酶切位點（上游引物：5′- CGGggtaccCCGat

gactgcaaatgccaagctcgac-3′，下游引物：5′-CCCaagc

ttGGtcaatt tgggaaatcgat-3′，下劃線為酶切位點）。以香蕉全蛋白pQE80L-MaPPO1質粒為模板進行PCR擴增。PCR產物電泳檢測后回收，與pQE80L質粒分別進行KpnⅠ和HindⅢ雙酶切，酶切產物回收后按一定分子比進行連接轉化，挑取陽性克隆子提取質粒并進行PCR、酶切及測序等驗證。

1.2.3 融合蛋白的誘導表達 挑取鑒定正確的陽性克隆單菌落接種至同時含有氨芐（Amp，50 μg/mL）和卡那霉素（Kan，50 μg/mL）的LB液體培養基中，37 ℃過夜震蕩培養；再按1 ∶ 100的比例同樣接種于LB液體培養基中，37 ℃振蕩培養至OD600約為0.6時，加IPTG至終濃度0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L時誘導6 h；離心并收集菌液，4 ℃，12 000×g離心1 min；棄上清液，將菌體用磷酸緩沖溶液洗滌后煮沸破碎，SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白的表達情況。以空的宿主菌和含表達載體的宿主菌為對照，培養和誘導條件同上。

1.2.4 包涵體含量分析 菌液離心，用磷酸緩沖溶液重懸收集的菌體，菌液保持在冰浴狀態超聲破碎20 min（超聲5 s，停歇30 s，再超聲5 s），超聲破碎后，12 000 r/min離心3 min，SDS-PAGE電泳檢測分析超聲后全液、離心后上清液和沉淀中蛋白表達情況。

1.2.5 包涵體的變性與復性 將pQE 80L-MaPPO533進行大量誘導表達后，收集菌體，超聲破碎、離心，收集沉淀，得到粗制包涵體。用2 mL變性Ⅰ溶液（50 mmol/L Tris-Cl pH7.5，5 mmol/L DTT，2%Tritonx-100，5 mmol/L NaCl）懸浮，12 000 r/min離心5 min，重復此操作一次，然后用2 mL變性Ⅱ[19.2 g尿素溶于40 mL Tris-Cl溶液（50 mmol/L、pH8.0）]溶液懸浮，4 ℃過夜變性。將懸浮液4 ℃ 5 000 r/min離心30 min，保留上清。將上清轉入7 500 Da的透析袋中，置于0.05 mol/L磷酸緩沖溶液（pH6.5）溶液中，4 ℃透析12 h，每隔4 h換一次磷酸緩沖溶液。收集透析袋內的液體，4 ℃ 、5 000 r/min離心30 min，上清是復性的蛋白。

1.2.6 包涵體純化 首先如1.2.5得到蛋白變性溶液后，取1 mL裝入10 mL離心管；然后顛倒混勻樹脂，用3 mL無菌水懸浮樹脂，500 r/min離心5 min，棄上清，并重復此步驟2次；接著用6 mL的Native binding buffer平衡樹脂，500 r/min離心5 min，棄上清，再加入3 mL Native binding buffer；取1 mL蛋白質變性溶液與樹脂4 ℃混合2～3 h，500 r/min離心5 min，棄上清；用4 mL的Native wash buffer懸浮樹脂，500 r/min離心5 min，棄上清，重復3次；最后用2 mL的Native Elution buffer（含250 mmol/L咪唑）懸浮樹脂，4 ℃混合1～2 h，500 r/min離心5 min，收集上清。

1.2.7 表達產物的酶活性分析 參照Galeazzi等[18]的方法。

1.2.8 重組蛋白質質譜鑒定 從 SDS-PAGE 的凝膠上切下重組蛋白條帶，送至南京農業大學進行基質輔助激光解吸附電離飛行時間質譜分析。

2 結果與分析

2.1 香蕉PPO轉移肽位置的確定

TargetP 1.1 Server在線預測蛋白N端導肽形式，結果顯示導肽為cTP（葉綠體導肽）、mTP（線粒體導肽）、SP（信號肽）的可能分值分別為0.878、0.118和0.038（表1），說明香蕉PPO全蛋白導肽為cTP（葉綠體導肽）的可能性最大，即香蕉PPO存在于葉綠體的可能性最大。另外，利用ChloroP 1.1 Server軟件對其葉綠體轉移肽進行在線預測，結果見表2，香蕉PPO存在轉移肽的可能性為0.549，大于0.5，因此認為香蕉PPO含有長度為47個氨基酸的轉移肽。所以在香蕉PPO全蛋白（登錄號：KF900300.1）的基礎上，切除了其N端55個氨基酸，以第56個氨基酸即蛋氨酸作為香蕉PPO成熟蛋白的起始氨基酸。香蕉PPO成熟蛋白命名為MaPPO533，成熟蛋白對應的基因命名為MaPPO533。

2.2 MaPPO533基因克隆及原核表達載體的鑒定

以本實驗室已構建的香蕉pQE80L-MaPPO1重組質粒為模板，進行MaPPO533基因擴增。PCR產物電泳檢測結果顯示，在1 600 bp左右有明顯的粗帶，與預期片段大小一致，說明成功克隆到MaPPO533基因（圖1-A）。酶切后的MaPPO533與同樣經雙酶切的原核表達載體pQE80L進行連接轉化，構建原核表達載體pQE80L-MaPPO533。對構建的pQE80L-MaPPO533質粒進行KpnⅠ和Hind Ⅲ雙酶切，產物電泳結果呈現出清晰的2條帶（圖1-B），分別為pQE80L（4 800 bp）和MaPPO533（1 599 bp），測序結果也證實連接成功。

2.3 MaPPO533成熟蛋白的原核表達

對香蕉pQE80L-MaPPO533 M15進行蛋白表達。SDS-PAGE電泳結果顯示pQE80L-MaPPO533在IPTG誘導后于約62 ku處有一條特異性帶，與其重組質粒的目的蛋白理論分子量大小基本一致，而經IPTG誘導的pQE80L空載體則無該目的條帶，說明香蕉pQE80L-MaPPO533在大腸桿菌中成功表達，并且隨著IPTG濃度的增大，蛋白表達量逐漸增大，當IPTG濃度為0.6 mmol/L時，表達量達到最大值（圖2）。

2.4 pQE80L-MaPPO533表達產物包涵體含量分析

pQE80L-MaPPO533宿主菌經培養、誘導表達、超聲破碎、離心后，分別取全液、上清液和沉淀進行SDS-PAGE電泳分析（圖3），目的蛋白主要在沉淀中，上清中看不到表達條帶，說明表達產物主要以包涵體形式存在，這可能與pQE80L-MaPPO533表達量小及原核表達通常存在目的蛋白以包涵體的形式表達有關。

2.5 包涵體的變性、復性及酶活力分析

包涵體為不溶性蛋白，無酶活力，故對香蕉pQE80L-MaPPO533包涵體進行變性和復性，以獲得可溶性的香蕉MaPPO533。本研究中香蕉pQE80L-MaPPO533包涵體經系列溶液洗滌、溶解和超濾復性后，SDS-PAGE電泳顯示得到單一的目的條帶，基本去除雜蛋白，但目的條帶弱（圖 4）。同時，以鄰苯二酚為底物，檢測目的蛋白超聲破碎后全液的酶活力為4.07 U/mg，而復性蛋白的酶活力為23.61 U/mg，酶活力提高了5.8倍。

2.6 蛋白質測序驗證

將目的條帶進行激光輔助解析/飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）測序（圖5），并通過Mascot軟件對質譜所得數據進行檢索鑒定，結果如圖6所示，最后確定重組表達蛋白為香蕉PPO。

3 討論與結論

前人研究結果表明，轉移肽幾乎存在于所有植物的PPO中[19-20]。在植物細胞內轉移肽具有運輸PPO并定位放置PPO的功能，并在完成相關功能后被切除，從而形成成熟的PPO蛋白[19-20]。但在大腸桿菌中，真核基因的轉移肽不能被大腸桿菌識別，從而不能形成正確的剪切和折疊，而且導肽位于蛋白翻譯起始序列，這部分沒有功能但是非常疏水，因此往往導致PPO全長基因在大腸桿菌中難以表達， 劉敬衛等的研究結果也表明N端的導肽序列對蛋白的正確折疊確有影響，切去導肽后可降低基因對大腸桿菌的毒害作用，有利于蛋白表達量的增加，并且目前已有對多酚氧化酶原核表達的報道，基本都將PPO基因的導肽切除，然后進行原核表達[21-23]。筆者之前對香蕉PPO全長基因誘導表達，就存在未表達的情況。但本研究對香蕉PPO全蛋白進行轉移肽去除后，成功表達出了目的蛋白，說明可能也存在N端的導肽序列對蛋白的正確折疊產生影響，從而影響蛋白表達的可能。

MaPPO533蛋白表達時主要形成包涵體，上清中幾乎沒有可溶性蛋白。包涵體是細菌表達的蛋白質在胞內互相凝集而形成的無活性固體顆粒，是大腸桿菌異源表達時的常見現象[24]。包涵體蛋白雖然往往無生物活性，需要重新溶解和復性，但包涵體的形成有利于防止蛋白酶對表達蛋白的降解，增加了產物的穩定性，同時包涵體中雜蛋白的含量少，這也為重組蛋白的分離與純化帶來了極大的方便，通過對包涵體的純化，可得到純度較高的目的蛋白[25-26]。為此，筆者們采取了對包涵體的變性復性研究，雖然電泳顯示目的條帶較弱，但酶活性測定結果表明，復性后酶活力是復性前的5.8倍。為了得到大量高活性的香蕉PPO重組蛋白，在今后的研究中可嘗試將香蕉PPO進行真核表達。

綜上所述，本實驗通過生物工具在線分析對克隆得到的香蕉PPO全蛋白進行了轉運肽分析，然后去除并成功實現了香蕉成熟PPO蛋白的原核表達，并通過質譜鑒定，結果確定重組表達蛋白為香蕉PPO。這將對從基因水平和蛋白水平研究香蕉多酚氧化酶在香蕉褐變生理和調控機制中的作用有一定的指導作用。

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