劍麻斑馬紋病菌5個多聚半乳糖醛酸酶基因的克隆與序列分析

吳偉懷　梁艷瓊　鄭金龍　習金根　鄭肖蘭　李銳　劉巧蓮　張馳成　賀春萍　易克賢

摘 要 以寄生疫霉菌多聚半乳糖醛酸酶pppg1～pppg5等5個基因cDNA序列為參考，設計基因編碼區特異性引物。利用5對引物分別對劍麻斑馬紋病菌進行分子檢測以及基因同源克隆。通過此方法首次從劍麻斑馬紋病菌中獲得了5個多聚半乳糖醛酸酶基因，并分別命名為Szpg1～Szpg5。檢測結果表明，Szpg1～Szpg5基因普遍存在于被檢測劍麻斑馬紋病菌中。序列分析結果表明，Szpg1～Szpg5基因與pppg1～pppg5對應基因之間存在核苷酸序列差異，由此導致個別氨基酸的差異，甚至提前終止。由此推測，Szpg1～Szpg5基因與pppg1～pppg5在功能上可能存在著一定的差異。

關鍵詞 劍麻斑馬紋病；多聚半乳糖醛酸酶；基因克隆

中圖分類號 S432.4；Q78 文獻標識碼 A

Cloning and Sequence Analysis of Five Polygalacturonase

Genes of Phytophora nicotianae in Sisal

WU Weihuai1， LIANG Yanqiong1， ZHENG Jinlong1， XI Jingen1， ZHENG Xiaolan1，

LI Rui1， LIU Qiaolian2， ZHANG Chicheng3， HE Chunping1 *， YI Kexian1 *

1 Environment and Plant Protection Institute， CATAS / Ministry of Agriculture Key Laboratory for Monitoring and Control

of Tropical Agricultural and Forest Invasive Alien Pests / Hainan Key Laboratory for Detection and Control of Tropical

Agricultural Pests， Haikou， Hainan 571101， China

2 Institute of Tropical Biosciences and Biotechnology， CATAS， Haikou， Hainan 571101， China

3 College of Environment and Plant Protection， Hainan University， Haikou， Hainan， 570228， China

Abstract Sisal zebra disease caused by Phytophora nicotianae var. parasitica is a kind of main diseases which cause serious damage to the sisal. In this study， five specific primer pairs were designed in coding region based on the reference sequence of pppg1 to pppg5 gene from Phytophora parasitica. Five specific primer pairs were used for the molecular detection and gene cloning from sisal zebra pathgoen DNA. This is the first time from sisal zebra isolating five polygalacturonase genes through this method， and respectively designated as Szpg1 to Szpg5. The detecting results showed that Szpg1 to Szpg5 genes were widely distributed in the sisal zebra isolates. Sequence analysis results showed that there were sequence differences between Szpg1 to Szpg5 and pppg1 to pppg5， respectively， leading to some amino acid differences， and even early termination. Thus it is speculated that Szpg1 to Szpg5 genes may exist a certain differences in function. This research would lay a solid foundation for the further study of sisal zebra germs polygalaturonase role in the pathogenic process.

Key words Sisal zebra disease； Polygalaturonase； Cloning

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.12.016

植物細胞壁是寄主與病原菌互作的重要場所，病原菌定殖于寄主表面后只有穿透細胞壁的屏障并與之建立了寄生關系，才能表現出致病性，在此過程中細胞壁降解酶發揮了極其重要的作用[1]。而由植物病原菌分泌的細胞壁降解酶主要包括多聚半乳糖醛酸酶（Polygalaturonase， PG）、果膠裂解酶、果膠甲基酯酶和β-半乳糖苷酶，其中PG在致病力和細胞壁降解酶中起著最為重要的作用[2]。已有研究結果表明，PG在植物病原菌侵染寄主過程中降解果膠，為病原菌順利與寄主建立寄生關系奠定基礎，是重要的致病因子之一。如當黃曲霉菌（Aspergillus flavus）內源多聚半乳糖醛酸酶基因pecA表達時，有利于病原菌在棉桃中的侵入與傳播[3]。BcPG1（Botrytis cinerea polygalacturonase 1）基因突變后能導致灰葡萄菌（Botrytis cinerea）對寄主植物的毒性減弱[4]。而侵染柑橘果實的鏈格孢菌（Alternaria citri）的內切PG基因突變后在柑橘類與馬鈴薯組織中產生黑腐癥狀的能力明顯地減弱[5]。與之相似，由突變而產生的內切PG基因活性喪失的麥角菌（Claviceps purpurea）突變菌株幾乎對黑麥不致病[6]。

由煙草疫霉（Phytophora nicotianae var. parasitica或Phytophora parasitica var. nicotianae）引起的劍麻斑馬紋病（Sisal zebra disease）是一種嚴重危害劍麻的主要病害。如遇高溫多雨季節容易發生病害流行，造成植麻區麻田早期大量缺株，嚴重影響劍麻產業的發展。該病曾于1973年在我國暴發并流行，成為劍麻生產影響最大的病害。雖然該病目前得到了有效控制，但是在高溫多雨季節仍可爆發成災。前期，國內外對于劍麻斑馬紋病菌的研究主要集中在該菌的致病性分化、生物學特性以及防治藥劑等研究方面，而沒有從PG這個關鍵的致病酶著手的研究報道。目前，已從寄生疫霉菌（Phytophora parasitica）中克隆了pppg1～pppg10共10個PG基因[7-8]。這為研究劍麻斑馬紋病菌中的PG基因提供了方便。為此，本研究以這些基因序列為參考序列設計基因特異引物，對劍麻斑馬紋病菌中PG基因進行了克隆（命名為Szpg）與測序；為下一步研究劍麻斑馬紋病菌PG對劍麻致病過程中的作用奠定基礎。本研究中即報道了Szpg1～Szpg5等5個基因的克隆與序列分析工作。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

本研究中用于分子檢測的12個劍麻斑馬紋病菌分別收集自廣東、廣西、海南等劍麻種植區。其中廣東菌株8個，廣西菌株2個，海南菌株2個。菌株現保存于中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所。其具體相關信息見表1。

1.2 方法

1.2.1 菌絲體收集及DNA提取 利用馬鈴薯葡萄糖液體培養基對各供試菌株進行搖菌，28 ℃，160 r/min培養6 d 后，對菌絲體進行收集。收集的各菌絲體迅速于液氮中研磨，后進行基因組DNA提取。DNA提取采用DNA提取試劑盒（E.Z.N.A Fungal DNA kit， Omega公司，美國）提取，具體實驗步驟參考其說明書進行。

1.2.2 RNA的提取及cDNA的合成 在馬鈴薯葡萄糖液體培養基培養劍麻斑馬紋病原菌菌株6 d后，收集菌絲體并立即進行總RNA提取。總RNA 抽提按TRIzol試劑盒（Gibco-BRL）操作方法進行。利用反轉錄試劑盒SuperscriptTM III Reverse Transcriptase （Invitrogen）進行cDNA的反轉錄合成。

1.2.3 引物設計 以寄生疫霉PG基因pppg1（AY697926）、pppg2（EU041943）、pppg3（EU041944）、pppg4（EU041945）、pppg5（EU041945）為參考序列[7-8]，利用軟件primer5.0于各基因啟始密碼子位置設計正向引物，而于終止密碼子處設計反向引物，使擴增產物包含完整的編碼區。用于對gDNA與cDNA的擴增與克隆。設計引物參考下列原則：引物一般要求GC含量40%～65%，Tm值55～65 ℃，引物序列長18～25 bp，且無錯配、不形成二聚體和發夾結構等。設計好的引物委托英駿生物技術有限公司合成。具體引物序列見表2。

1.2.4 PCR擴增及反應條件 基因組PCR反應體系為20 μL，含有20～30 ng DNA模板，10 μL 2×EcoTaq PCR SuperMix，上下游引物各0.5 μL（10.0 μmol/L），最后以ddH2O補齊。PCR反應在 Mastercycler gradient Mastercycler PCR擴增儀上進行，擴增程序為：94 ℃預變性3 min；隨后94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，擴增35個循環；最后72℃延伸5 min，20 ℃保存。PCR擴增產物在1%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，紫外燈下照相并保存。cDNA PCR擴增參照基因組體系及條件，擴增所使用的高保真酶購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2.5 克隆與序列分析 以菌株ND-12 DNA為模板，分別回收各基因的gDNA與cDNA擴增子，各取4 μL與pEASYTM Cloning Vector連接，轉化大腸桿菌感受態細胞，經藍白斑篩選后，各選取3個陽性克隆送英駿生物技術有限公司測序。獲得的序列經人工去除載體序列后，利用DNAStar software（www.DNAStar.com）進行序列拼接與相關分析。蛋白質序列相似性分析利用http：//www.uniprot.org/uniprot/？query網站完成；蛋白質的理論等電點（Theoretical isoelectric points， pI）和分子量（molecular weights， Mw）計算利用Compute pI/ Mw工具（www.expasy.ch/tools/pi_tool.html[9]）進行。

2 結果與分析

2.1 Szpg1～Szpg5基因分子檢測

利用所設計的5個基因特異引物對，分別以劍麻斑馬紋病菌菌株DNA為模板進行擴增。結果5對引物分別從12個供試菌株中均擴增出目標條帶。具體而言，引物pppg1F/R從12個菌株中均擴增出特異條帶，其大小位于1～2 kb之間（圖1-A）；引物pppg2F/R和pppg3F/R也均從12個模板中擴增出目標條帶，大小均與預期比較相似，約為1.1 kb（圖1-B；Szpg2基因分子檢測圖未列出）；而引物pppg4F/R和引物pppg5F/R從12個供試菌株中擴增出1條比1 kb大的單一條帶（圖1-D）。由此表明，Szpg1～Szpg5基因在12個劍麻斑馬紋病菌菌中是普遍存在的。

2.2 Szpg1～Szpg5基因編碼區分析

利用5對引物分別擴增菌株ND-12的gDNA與cDNA。結果表明，5對引物均從cDNA與gDNA中擴增出條帶，而且來自cDNA的與其對應gDNA的擴增子大小無明顯差異（圖2）。

2.3 Szpg1～Szpg5基因編碼區序列分析及分子特征

對獲得的各基因的cDNA序列與相應基因組序列作比較。序列分析結果表明，通過引物pppg1F/R獲得了1 227 bp的序列，含有348、828 bp等2個外顯子以及1個51 bp的內含子。ORF Finder 軟件分析發現，完整ORF為1 176 bp，命名為Szpg1（依次類推）。推斷基因產物由391個氨基酸殘基組成，估計分子量為4.17 ku，等電點（pI）為5.57。與寄生疫霉PG基因pppg1的序列相比，Szpg1基因在編碼區存在3個核苷酸差異，其中一個為非同義突變（圖3-A），其氨基酸序列一致性水平為99%。

通過引物pppg2F/R獲得了Szpg2基因1 155 bp序列，預測為1個連續完整的ORF，編碼384個氨基酸，估計分子量為3.99 ku，等電點（pI）為9.17。與pppg2的序列相比，Szpg2基因編碼區存在30多個核苷酸差異，最終導致24個氨基酸的差異，其氨基酸序列一致性水平為93%（圖3-B）。

利用引物pppg3F/R獲得了Szpg3 1 155 bp的基因序列，ORF Finder 軟件分析發現為1個連續完整的ORF，編碼384個氨基酸，估計分子量為3.98 ku，等電點（pI）為9.25。與pppg3的序列相比，Szpg3在編碼區存在18個核苷酸差異，以及12個核苷酸插入。最終導致14個氨基酸的差異（圖3-C），其氨基酸序列一致性水平為96%。

通過引物pppg4F/R獲得了1 089 bp的Szpg4基因序列，為1個連續完整的ORF，編碼362個氨基酸，估計分子量為3.73 ku，等電點（pI）為6.71。與pppg4的序列相比存在5個核苷酸差異，其中1個為非同義突變（圖3-D），其氨基酸序列一致性水平為99%。

通過引物pppg5F/R獲得了Szpg5基因1 083 bp的序列， 與pppg5的序列相比，Szpg5其核苷酸序列存在7個核苷酸的差異。值得一提的是，在第73位的核苷酸的突變（C73T），與第74及75位核苷酸AA，形成了一個終止子，導致提前終止。由此推測，該基因并不具有正常功能（數據未列出）。

總之，來自劍麻斑馬紋病菌Szpg1至Szpg5基因中，除Szpg1中含有1個51 bp的內含子外，其余基因并無內含子。其編碼區序列與寄生疫霉PG基因pppg1～pppg5對應基因之間存在核苷酸差異，尤其是Szpg2與Szpg3基因。此外，Szpg5基因由于單核苷酸的突變從而導致提前終止。

3 討論與結論

近年來，國際上有關卵菌PG基因族的研究已有一些報道。目前，研究卵菌多聚半乳糖醛酸酶基因比較多的是樟疫霉（P. cinnamomi）與致病疫霉（P. infestans）和寄生疫霉（P. parasitica）。對于卵菌的第一個內切PG基因pipg1則是從馬鈴薯晚疫病菌致病疫霉分離到的，該基因編碼的內切多聚半乳糖醛酸酶具有致病活性[10]。此外，對樟疫霉（Phytophthora cinnamomi）致病菌PG基因家族的研究，發現受試致病性菌的PG基因家族組成較大，含有19個pg基因（Pcpg1～Pcpg19），其中除Pcpg5、Pcpg18、Pcpg13等3個基因外，其余的多個基因間具有明顯的網絡關系，并且發現關鍵pg基因編碼的蛋白質一級結構的主要結構基團的修飾特性與PG致病活性密切相關[11]。而鞏振輝等[12-14]又對其若干個pg基因的遺傳轉化進行了研究，發現pg基因均能指導合成相應的PG酶，并具有不同的活性。并同時發現其中編碼該酶的具有不同程度糖基化的pg基因對該酶的致病性起著至關重要的作用。與之相似，寄生疫霉內切PG基因事實上是一個多基因家系，除了pppg1之外[7]，至少還包含pppg2～pppg10等9個基因[8]。

盡管目前已從多種病原菌中分離到了多聚半乳糖醛酸酶基因，但在劍麻斑馬紋病菌中分離還未見報道。本研究利用同源克隆法首次對劍麻斑馬紋病菌中細胞壁降解霉基因Szpg1～Szpg5的編碼區進行了分子檢測以及克隆及序列比較分析。通過本實驗表明它們在劍麻斑馬紋病菌中普遍存在，除Szpg5基因由于變異而提前終止外，其余Szpg1～Szpg4基因與寄生疫霉pppg1～pppg4對應基因序列具有高度的相似性，其氨基酸序列一致性均在90%以上。除此之外，基因之間也存在不少核苷酸變異，甚至有些是非同義突變，究其原因可能是病原菌為適應不同寄主、環境而進化的結果。事實上，在基因與寄主之間的共進化中，病原菌在面對寄主強大的選擇壓時，導致了病原包括基因點突變、基因缺失等多種變異[15-16]。

根據已有的表達實驗表明，寄生疫霉基pppg2能導致本生煙明顯的黃花與矮小；pppg4基因本生煙上產生矮化表型；而pppg5基因使本生煙產生銀葉以及葉肉細胞嚴重變形[8]。在氨基酸水平上，來自劍麻斑馬紋病菌Szpg1～Szpg4（Szpg5提前終止）與寄生疫霉基因pppg1～pppg4之間在存在一些差異。這些氨基酸的差異，是否導致功能上的變化還有待進一步研究。

參考文獻

[1] Lionetti V， Francocci F， Ferrari S， et al. Engineering the cell wall by reducing de-methyl-esterified homogalacturonan improves sacchareification of plant tissues for bioconversion[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2010， 107： 616-621.

[2] Wei W， Yang J， Luo C M， et al. Synergism between cucumber а-expansion， fungal endoglucanase and pectin lyase[J]. J Plant Physiol， 2010， 167： 1 204-1 210.

[3] Shieh M T， Brown R L， Whitehead M P， et al. Molecular genetic evidence for the involvement of a specific polygalacturonase， P2c， in the invasion and spread of Aspergillus flavus in cotton bolls[J]. Appl Environ Microbiol， 1997， 63： 3 548-3 552.

[4] ten Have A， Breuil W O， Wubben J P， et al. Botrytis cinerea endopolygalacturonase genes are differentially expressed in various plant tissues[J]. Fungal Genet Biol， 2001， 33： 97-105.

[5] Isshiki A， Akimitsu K， Yamamoto M， et al. Endo-polygalacturonase is essential for citrus black rot caused by Alternaria citri but not brown spot caused by Alternaria alternata[J]. Mol Plant-Microbe Interact， 2001， 14： 749-757.

[6] Oeser B， Heidrich P M， Muller U， et al. Polygalacturonase is a pathogenicity factor in the Claviceps purpurea/rye interaction[J]. Fungal Genet Biol， 2002， 36： 176-186.

[7] Yan H Z， Liou R F. Cloning and analysis of pppg1， an inducible endopolygalacturonase gene from the oomycete plant pathogen Phytophthora parasitica[J]. Fungal Genet Biol， 2005， 42： 339-350.

[8] Wu C H， Yan H Z， Liu L F， et al. Functional characterization of a gene family encoding polygalacturonases in Phytophthora parasitica[J]. Mol Plant-Microbe Interact， 2008， 21（4）： 480-489.

[9] Gasteiger E， Hoogland C， Gattiker A， et al. （In） John M. Walker（ed）The proteomics protocols handbook[M]. Humana Press， 2005： 571-607.

[10] Torto T A， Rauser L， Kamoun S. The pipg1 gene of the oomycete Phytophthora infestans encodes a fungal-like endopolygalacturonase[J]. Curr Genet， 2002， 40： 385-390.

[11] Arvid Go··tesson， Jerry S Marshall， David A Jones， et al. Characterization and evolutionary analysis of a large polygalacturonase gene family in the oomycete plant pathogen Phytophthora cinnamomi[J]. Mol Plant- Microbe Interact， 2002， 15（9）： 907-921.

[12] 鞏振輝， Arvid Gotesson， David A Jones. 樟疫霉多聚半乳糖醛酸酶Pcpg1、 Pcpg2和Pcpg4基因的克隆、 測序及其遺傳轉化[J]. 農業生物技術學報， 2003， 11（5）： 477-482.

[13] 鞏振輝， Arvid Gotesson， David A Jones. 樟疫霉多聚半乳糖醛酸酶基因 9和10的克隆、測序及其遺傳轉化研究[J]. 西北農林科技大學學報， 2004， 32（8）： 1-6.

[14] 鞏振輝， 呂元紅， 王曉敏. 樟疫霉多聚半乳糖醛酸酶16和17基因的克隆、 測序及其真核表達研究[J]. 西北農林科技大學學報， 2005， 33（6）： 1-6.

[15] Armstrong M R， Whisson S C， Pritchard L， et al. An ancestral oomycete locus contains late blight avirulence gene Avr3a， encoding a protein that is recognized in the host cytoplasm[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2005， 102： 7 766-7 771.

[16] Gilroy E M， Breen S， Whisson S C， et al. Presence/absence， differential expression and sequence polymorphisms between PiAVR2 and PiAVR2-like in Phytophthora infestans determine virulence on R2[J]. New Phytol， 2011， 191： 763-776.