華山松松塔提取物抗HIV活性部位中鉛含量的測定

張楨 孫幫燕 郭貴唐 羅建蓉

摘要[目的]為了分析華山松松塔提取物抗HIV活性部位中鉛含量。[方法] 應用石墨爐原子吸收光譜法，參照中華人民共和國藥典2010版[附錄Ⅸ B 鉛、鎘、砷、汞、銅測定法（一部）]測定活性部位中鉛含量。[結果]活性部位中鉛含量在中華人民共和國對外經濟貿易合作部《藥用植物及制劑進出口綠色行業標準》和《中國藥典》規定范圍（Pb≤5.0 mg/kg ）之內，沒有超標。[結論]該方法簡單、方便、快速、靈敏，為抗HIV活性部位重金屬鉛含量測試提供一種可靠的方法。

關鍵詞 含量測定； 鉛； 抗HIV活性部位；華山松； 石墨爐原子吸收光譜法

中圖分類號 S791.241文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2015）11-001-02

病原體為人免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus， HIV）的疾病，臨床上稱其為獲得性免疫缺陷綜合癥（Acquiredimmune deficiency syndrome/AIDS）。如果機體感染HIV，那么機體的免疫細胞功能將會衰退且免疫細胞數量會衰退，導致機體增加惡性腫瘤發生機率或感染，最終導致感染者死亡。HIV不僅嚴重威脅著人類的健康，而且阻礙全球經濟和社會的發展[1]。目前，盡管美國批準上市的HIV的藥物有20多種，但是價格昂貴、毒副作用大，作用環節單一，易出現耐藥性[2-3]。

松科松屬植物資源豐富，全世界約100多種。我國松屬植物分布極廣，合計50余種（有22種，10個變種，引進16種，2個變種）[4]。據《本草綱目》記載，松塔具有祛痰、祛風、止咳平喘、安神和潤腸等功效[5]。在我國，已有13種被列入藥用的松屬植物，其能入藥部位主要為松塔及松子、松針、松脂、松節等。從目前松塔研究報道中發現，松塔中含有多糖、酚類、木質素類、萜類、黃酮類多種化學成分，且發現松塔藥理活性具有抗病毒、抗腫瘤、抗菌、增強免疫力等作用[6-8]。

盡管中華人民共和國藥典把13種松屬植物列入藥用，但目前報道松屬的松塔藥用開發不是很多，尤其關于松塔抗HIV藥用的研究報道很少[9]。為此，筆者對采集于云南省巍山縣的華山松（Pinus armandii Franch.）松塔進行研究，測定松塔提取物中（抗HIV治療指數>30）鉛的含量，為進一步研究抗HIV藥物質量標準打下基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

取干燥的華山松（P. armandii Franch.）松塔（生藥學馬曉寬教授鑒定）5 kg，粉碎，用一定濃度的乙醇（90%）在室溫條件下提取2次（2×9 L），每次12 h。過濾，殘渣用水浸泡提取，過濾后殘渣中加堿液（濃度4%氫氧化鈉）浸泡提取，過濾，向得到的堿性濾液加入酸（用乙酸調pH），濃縮到適量體積，加入乙醇混勻，靜置12 h，過濾得到粗提取物Ⅰ；在濾液中繼續加醇液，靜置12 h，過濾得到粗提取物Ⅱ；濾液中再加醇液，靜置12 h，過濾得到粗提取物Ⅲ。

1.2 試驗方法

1.2.1測定條件。波長為283.1 nm[5]；背景校正為塞曼效應；狹縫0.7 nm；樣品進樣量17 μl，0.5%基體改進劑硝酸鎂和硝酸鈀的混合液3 μl，高純氬氣為保護氣（250 ml/min）。升溫程序（表1）： 第1次干燥溫度110 ℃， 坡升時間1 s， 持續時間30 s；第2次干燥溫度130 ℃， 坡升時間15 s， 持續時間30 s；灰化溫度850 ℃，坡升時間10 s，持續時間20 s；原子化溫度1 600 ℃，坡升時間0 s，持續5 s；凈化溫度2 450 ℃，坡升時間1 s，持續時間3 s。

1.2.2鉛標準儲備液和標準使用液的制備。

精密量取鉛單元素標準液（GB08619）適量，用濃度2%硝酸溶液稀釋，即得1 μg/ml鉛標準儲備溶液，冰箱中0～5 ℃保存[5]。精密量取鉛標準儲備液適量， 用濃度2%硝酸溶液稀釋，配制400 ng/ml標準使用液（用時現配）。

1.2.3標準曲線的制備。 分別精密量取鉛標準使用液0、0.312、0.625、1.250、2.500、5.000、10.000 ml于25 ml容量瓶中，用濃度2%硝酸溶液定容至刻度，搖勻，即得0、5、10、20、40、80、160 ng/ml的溶液。按“1.2.1”用自動進樣器自動進樣，于石墨爐原子吸收光譜儀上測試。扣除試劑空白，以吸光度值（A）對鉛濃度（C， ng /ml）做線性回歸處理，回歸方程為：A=0.002 85C+0.003 93，相關系數（r）=0.999 0，線性范圍為0～200 ng/ml。

1.2.4樣品測定。

參照中華人民共和國藥典[2010版附錄Ⅸ B 鉛、鎘、砷、汞、銅測定法（一部）（B法）]處理標本[5]，分別精密稱取3種抗HIV活性部位（治療指數>30）[4]樣品0.20g，置三角瓶中，加硝酸/高氯酸（4∶1）10 ml，瓶口加一小漏斗，浸泡過夜，在通風廚里置電熱板上加熱消解，保持微沸，直至濃煙散盡，消解液呈透明，再加去離子水，待白煙散盡，定容至25 ml。同時，制備空白液，按測定條件進行測定。

2 結果與分析

2.1 方法學考察

2.1.1精密度試驗。取松塔樣品Ⅰ～Ⅲ，按“1.2.4”項中的方法和步驟進行操作，重復測定吸光度6次。表2表明，樣品Ⅰ～ⅢRSD分別為1.50%、1.77%、1.53%，說明該方法精密度良好。

2.1.2穩定性試驗。取松塔樣品Ⅰ～Ⅲ，按“ 1.2.4”項中的方法和步驟進行操作，每隔20 min測定一次吸光度。表3表明，2 h內顏色變化較小，不影響測定。

2.1.3回收率試驗。采用加標回收法，取松塔樣品Ⅰ～Ⅲ，加入 0.5～2.0倍標準品，按“1.2.4”項中的方法和步驟進行操作，測定其吸光度，并且計算回收率。表4表明，平均回收率為99.79%，RSD為4.45%。

2.1.4方法檢出限。參照中華人民共和國對外經濟貿易合作部《藥用植物及制劑進出口綠色行業標準》[10]，該法檢出限為5.0 μg/kg。

2.1.5評價結果。采用《中國藥典》[5]（2010年版）和中華人民共和國對外經濟貿易合作部《藥用植物及制劑進出口綠色行業標準》[10]重金屬最高限定的標準評價。

結果表明，提取物Ⅰ～Ⅲ 鉛含量分別為3.41、2.71、2.92 mg/kg，低于中華人民共和國對外經濟貿易合作部《藥用植物及制劑進出口綠色行業標準》（Pb≤5.0 mg/kg）和《中國藥典》（2010年版）重金屬最高限定的標準（Pb≤5.0 mg/kg）；超標率為0。

3 討論

在取樣和樣品消解過稱中，所有玻璃儀器均需以16.67%硝酸浸泡過夜，用水反復沖洗，最后用去離子水沖洗，以免污染試樣。石墨爐原子吸收光譜分析法是一種靈敏度高、適合測定鉛的測試技術，但是存在基體干擾嚴重等缺點，故在石墨爐原子吸收分光光度分析工作中，應注意背景和其他原因引起的對測定結果的干擾。如，儀器工作原子化條件可能影響儀器的靈敏度、穩定程度。試驗中，選擇塞曼效應為背景校正系統[7]。該研究表明，濃度0.5%硝酸鎂和硝酸鈀是一種良好的基體改進劑，因此在校準曲線和標本測試過程中，設置自動進樣器同時加入改進劑，就可以滿足測定需要，減少測試步驟，避免基體干擾測試結果。按提取工藝對采自于云南省巍山縣的華山松（Pinus armandii Franch.）松塔進行處理，得到抗HIV活性部位鉛含量沒有超標。

參考文獻

[1]劉武青， 李磊珂， 鄭永唐， 等.中藥復方涼茶提取物體外抗HIV活性研究[J].中藥材， 2010， 33（9）：1433-1437.

[2] 張楨，張鵬， 劉光明， 等.華山松松塔中抗HIV活性部位多糖的含量測定[J]. 時珍國醫國藥， 2010， 21（10）：2435-2436.

[3] 劉光明，呂永俊，李好枝，等. 云南松松塔中抗HIV活性成分研究初報[J]. 大理學院學報，2009，8（2）：69.

[4] 鄭萬均.中國樹木志[M].北京：中國林業出版社， 1983：148.

[5] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典2010版[M].北京：中國醫藥科技出版社，2010.

[6] NAGATA K， SAKAGAMI H， HARADA H， et al. Inhibition of influenza virus infection by pine cone antitumor substances [J]. Antiviral Res， 1990， 13（1）：11-21.

[7] FUKUCHI K， SAKAGAMI H， IKEDA M， et al. Inhibition of herpessimplex virus infection by pine cone antitumor substances [J]. Anticancer Res， 1989， 9（2）：313-317.

[8] OH-HARA T， SAKAGAMI H， KAWAZOE Y， et al. Antimicrobialspectrum of lignin-related pine cone extracts of Pinus parviflora Sieb. et Zucc [J]. In Vivo， 1990， 4（1）：7-12.

[9] 張楨， 李春艷， 劉光明， 等. 華山松松塔體外抗HIV活性的研究[J]. 時珍國醫國藥， 2014， 25（1）：25-26.

[10] 中華人民共和國對外經濟貿易合作部. 藥用植物及制劑進出口綠色行業標準[S].北京：中國標準出版社， 2001.

責任編輯 劉月娟 責任校對 李巖