花生組織培養及遺傳轉化研究進展

張鐃丹　何龍飛

摘要 概述了近年來國內外花生組織培養與遺傳轉化的主要研究進展。花生的再生體系已有不少成功報道，但仍存在基因型差異大、再生率低、生長慢等問題。通過農桿菌介導法、基因槍轟擊法和花粉管通道法等途徑的遺傳轉化也獲得了成功，但應用創新種質資源及其利用還有待加強。指出建立高效穩定的花生再生體系和遺傳轉化創新種質是今后的研究重點。

關鍵詞 花生；組織培養；高效再生；遺傳轉化；基因工程

中圖分類號 S565.2 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）11-027-03

花生（Arachis hypogaea L.）是全球，特別熱帶、亞熱帶地區最重要的油料作物與經濟作物之一，種植廣泛。然而，花生栽培普遍存在產量低、病蟲害危害嚴重、品質適用性窄等問題。通過品種改良是解決這些問題的重要途徑。但可利用基因資源的匱乏、優良抗性基因源與不良性狀緊密連鎖以及種間雜交不親和性等因素極大地限制了花生傳統育種的發展，利用基因工程技術，加快花生育種進程越來越受到重視。花生基因工程育種的關鍵是建立高效的再生體系，為轉基因提供充足的受體材料，而通過遺傳轉化，創新大量種質資源，是進行系統選育的前提。

1 花生組織培養

花生組織培養對花生的品種改良、新品種繁殖、遺傳轉化、種質保存和抗性突變體的篩選等具有重要意義。自20世紀50年代末期Steward培養花生韌皮組織開始，花生組織培養至今已有50多年的歷史，近十幾年來有關花生再生植株的研究逐漸增多。以花生植物莖尖、未成熟的合子胚、未成熟的葉片、子葉為外植體，進行離體培養并獲得再生植株[1]（表1）。

苗利娟等[2]從22個花生品種中篩選出4個叢生芽高誘導率的花生品種，并指出花生種子在1/2MS培養基上萌發率比在MS培養基上稍高；添加500 mg/L羧芐青霉素（Carbenicillin）對花生幼葉叢生芽分化無抑制作用，叢生芽誘導率可提高13.5個百分點；頭孢霉素（Cefalexin）對芽誘導具有抑制作用，叢生芽誘導率下降48.5個百分點。黃玲等[3]研究指出，幼葉外植體分化不定芽頻率明顯高于子葉、上胚軸和下胚軸；6 d葉齡的葉片中間切段為最佳；不同基因型不定芽分化率存在明顯差異。

隋炯明等[4]以不同類型18個花生品種成熟種子的胚小葉為外植體，對不定芽誘導及植株再生的研究表明，所有供試品種芽點誘導率均高于60%，但五大類型間及品種間存在顯著差異，龍生型平均誘導率最高，其次是珍珠豆型，多粒型最低。植株再生率差異顯著，最高的是珍珠豆型，最低是多粒型。馬彩霞等[5]以14份不同花生品種的胚小葉為外植體，篩選出最佳芽誘導培養基、伸長培養基和高效再生基因型。不同品種再生率在25.51%～93.01%，每個叢生芽伸長數達到7.24，時間縮短至21～28 d；并利用“弗落蔓生”在15 d內得到了生根組培苗。尤淑麗[6]選用外引及自選共8個花生品種胚小葉作為外植體，研究愈傷組織誘導率和不定芽分化率，結果表明，品種間愈傷組織誘導率和不定芽分化率均差異顯著。徐娟等[7]對4個花生品種上胚軸及胚小葉的不定芽誘導及其成苗、生根試驗發現，不同基因型花生品種的再生能力差異顯著，其中湘花2008和中花8號的不定芽誘導率、成苗率和生根率均較高。

趙明霞等[8]指出，平陽霉素（PYM，Pingyangmycin）對體胚發生有顯著的抑制作用，隨著平陽霉素濃度的增大，體胚誘導率顯著下降。2個供試品種花育20號和花育22號的抑制濃度不同，綜合褐化率和體胚形成率，適宜的PYM離體誘變濃度分別為3～4 mg/L和4～5 mg/L，誘變培養時間為30 d。王莉莉等[9]在快中子輻照對花生胚小葉體細胞胚胎發生的影響研究發現，快中子輻照對誘導花生基因突變是有效的，推斷14.0 Gy為適宜的誘變劑量。

劉艷芝等[10]以花生優良品種四粒紅成熟種子胚軸為外植體，誘導體細胞胚發生率達到66.67%；體細胞胚在6-BA濃度逐漸降低的MS培養基上培養，發育成完整植株。蔣菁等[11]以花生品種“桂花30”和“桂花771”的胚小葉、下胚軸、子葉節為外植體，發現2，4-D的適宜濃度為10 mg/L，經過約30 d培養，可產生大量體細胞胚，平均誘導率分別為55.37%和36.72%，平均每個外植體產胚量分別為5.68個和4.27個。將誘導形成的體細胞胚轉接到6-BA濃度逐漸降低的MS培養基上培養，體細胞胚萌發再生成無根小苗，正常植株再生率分別為32.6%和23.5%。將無根苗轉接到生根培養基中可獲得完整植株。戴梓茹等[12]研究表明，不同激素種類對花生根愈傷組織誘導率的影響程度為6-BA>KT>2，4-D。

噻重氮苯基脲（Thidiazuron，TDZ）是一種新型高效的植物生長調節劑，它能直接或間接誘導外植體從愈傷組織形成到體細胞胚胎發生的一系列過程，具有生長素和細胞分裂素雙重作用的特殊功能[13-14]。研究發現，TDZ誘導的芽在伸長和生根上存在困難[15]。張月婷等[16]研究TDZ對不同基因型花生子葉節誘導叢生芽與擴繁中的作用，結果表明，叢生芽經擴繁后，雖能夠不斷新生叢生芽，但這些叢生芽的伸長和生根也存在困難，TDZ濃度越高，處理時間越長，叢生芽的再生越困難，這可能是由于TDZ長期的作用導致其再生能力下降。研究還發現，在萌發階段用TDZ處理而誘導和擴繁階段不添加TDZ時，產生的叢生芽較易伸長和生根，因此可考慮將擴繁的叢生芽經過一段時間不添加任何激素的恢復培養，再在含6-BA的伸長培養基上再生，以消除TDZ的抑制作用。

2 花生遺傳轉化

自1994年Eapen等[17]首次通過農桿菌介導法將外源基因整合到花生基因組以來，不斷有文獻報道了采用農桿菌介導法、基因槍轟擊法和花粉管通道法等技術進行花生遺傳轉化的研究。

2.1 農桿菌介導法農桿菌介導途徑主要是利用根癌農桿菌介導花生胚狀體、胚小葉、幼葉、子葉、胚軸、胚根等外植體，通過抗生素或除草劑抗性篩選獲得再生植株。相對于其他途徑，該方法具有操作簡便、不需昂貴設備、外源基因單拷貝或低拷貝整合、轉化頻率較高、遺傳表達穩定性較好等優點；且在眾多轉基因植物中80%是由農桿菌介導轉化的，因而農桿菌轉化已成為研究者進行花生基因轉化的首選方法。

FAD2基因編碼的Δ12脂肪酸脫氫酶是植物產生多聚不飽和脂肪酸的關鍵酶，石新國等[18]構建了帶有FAD2基因反義RNA干擾體和γ-TMT基因的種子特異表達單元的雙價種子特異表達載體pCAMBIA1300AT，并通過農桿菌C58介導轉化花生品種閩花6號，共得到21棵再生植株，PCR檢測結果表明，其中有3株為陽性苗，表明該完整表達單元的片段已整合到花生基因組中。殷冬梅等[19]在培育高油酸的花生新種質的研究中，以農桿菌為介導將含有油酸脫氫酶基因的植物雙元表達載體pFGC/2nd轉入花生，發現RNA干擾對內源的油酸脫氫酶基因產生了抑制作用。潘麗娟等[20]將控制花生蛋白質/油脂含量比例的關鍵酶——磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）的基因片段反向插入pCAMBIA1301-35S雙元表達載體，構建了帶PEPC反義基因的雙元載體并進行花生的轉化，獲得轉基因植株T1代種子。

劉強等[21]將在番茄心皮細胞分裂中起負調控作用并影響果重的重要數量性狀基因fw2.2轉化花生品種花育23號，獲得了12個PCR陽性的獨立轉化子。半定量RT-PCR結果表明，該基因在花和葉片中的表達量較低，而在幼胚中的表達量較高，且在野生種A.stenasperma的表達量明顯高于在栽培種魯花11號。

邱金梅等[22]研究發現，以帶子葉的胚軸為外植體，在OD600為0.7的菌液中，加入150 mg/L的表面活性劑（MES，methyl ester sulfonate），40 kPa真空處理10 min，共培養3 d后進行二次侵染，可顯著提高遺傳轉化率，GUS基因陽性表達率最高，達73.3%。

高明等[23]以花生下胚軸為外植體轉化花生品種四粒紅，在含有0.8 mg/L除草劑Basta（主要成分是草丁膦）的培養基中獲得67株抗性植株，經PCR檢測，5株為陽性，bar試紙條檢測至少有2株為陽性。

張廷婷等[24]利用基因芯片技術從抗、感黃曲霉花生品種中分離出差異表達基因PnLOX2，通過原核表達得到分子量為121.5 kD的融合表達產物，并構建了該基因的3′端反向重復結構，轉化花生，得到了轉基因花生苗，為反向鑒定PnLOX2基因在花生抗黃曲霉侵染過程中的功能奠定基礎。陳湘瑜等[25]將擬南芥AtTTG1基因的編碼區cDNA與“閩花6號”的花生果種皮特異啟動子S19共同構建于帶MAR序列的植物表達載體，旨在利用AtTTG1基因來改變花生果種皮抗黃曲霉這一物理屏障，增強花生抵抗黃曲霉侵染的能力。

Athmaram等[26]將BTVP2基因轉入花生體細胞使其產生抑制病毒的蛋白——藍舌病外衣殼蛋白。

姚慶收等[27]研究表明，以A600為0.8的發根農桿菌R1601菌液侵染花生葉片，在含50 μmol/L乙酰丁香酮的MS培養基培養時，可以高效地誘導得到花生毛狀根。同時，任艷等[28]也指出，花生的葉片、子葉、下胚軸均能被發根農桿菌GIM1.141誘導出發根，相同誘導條件下，各外植體的發根誘導率為葉片>子葉>下胚軸；適宜的菌液浸泡時間為10 min；附加乙酰丁香酮（100 μmol/L），發根誘導率明顯提高。

2.2 基因槍轟擊、花粉管通道與直接轉化法基因槍法本質上是一種物理過程，沒有宿主限制，對單子葉和雙子葉植物都能進行有效的轉化。且不受組織類型限制，靶受體類型廣泛，幾乎所有具有潛在分生能力的組織或細胞都可以用其進行轟擊轉化。桂大萍等[29]以花生上胚軸為外植體，利用基因槍將含GUS基因的pCAMBIA2301質粒載體轟擊體胚，外植體在添加5 mg/L毒莠定（Picloram）+1 mg/L谷氨酰胺（Glutamine）的MB培養基上誘導的體胚發生率、產胚數及植株再生率最高。不同基因型以中花8號體胚再生率最高（體胚誘導率為55.36%，植株再生率為56.79%）。在氦氣壓力為1 100 psi，轟擊距離為9 cm時，體細胞胚B-葡糖苷酸（GUS）瞬時表達率可達22.95%。

花粉管通道法不需要組織培養，技術簡單，基因型依賴性小，同時可以使用無標記的載體進行轉化從而避免抗生素污染。范乾程等[30]利用花生Oleosin基因的啟動子替換了pCAMBIA 1301的35S啟動子，構建了重組表達載體pCAMBIA 1301-Oleosin-pro，通過花粉管通道法導入花生，PCR鑒定和GUS組織化學染色顯示，50株轉基因植株有9株能擴增出目的條帶，陽性率為18%，高于之前報道的1%～10%；9株陽性轉基因植株中有5株子葉能被GUS染色，表明Oleosin基因啟動子驅動的GUS基因在油體蛋白中能夠表達。王亞等[31]也通過花粉管通道法，將攜帶條斑紫菜PyTPS基因的pCAMBIA 2300-PyTPS重組載體導入花生，獲得了T0轉基因植株，PCR檢測陽性率為34.7%；半定量RT-PCR分析與近紅外技術證實條斑紫菜PyTPS基因導入花生后，既可提高轉基因花生種子的耐鹽性，又對部分后代種子的品質性狀產生影響。

申紅蕓等[32]利用下胚軸縱切轉化法，建立了利用發根農桿菌介導花生下胚軸形成轉基因毛根和根瘤的新方法。花生下胚軸接種部位都有愈傷組織及毛根凸起形成，誘導率100%；毛根生長約20 d，其長度可達到10 cm以上，此時去除花生主根，毛根迅速生長，多級側根大量形成，同時有根瘤形成，說明該方法可以高效地轉化發根農桿菌進入并整合到花生基因組中，進而誘導花生產生大量的毛根，是一個高效的轉化方法。并分別用GFP和GUS 2種檢測方法對該轉化體系進行了檢測，證明利用該轉化體系可以獲得陽性的轉基因毛根和根瘤。該體系中，除前期農桿菌的培養在無菌條件下進行外，后續所有試驗在普通實驗室條件下即可進行，操作簡單，是一個易于掌握而且高效的研究體系。

3 問題與展望

近10年來，花生基因工程研究取得突破性進展，已建立了花生轉化和再生體系，但存在基因型差異大、再生率低、生長慢等問題，建立高效穩定的花生遺傳轉化和再生體系仍然十分必要。需要加強建立不同基因型花生高效植株再生體系，提高體細胞胚的誘導效率，利用組織培養與化學誘變篩選各種不同抗性材料，農桿菌轉化體系獲得到穩定表達的轉基因植株，通過遺傳轉化創新種質資源及其應用等問題的研究。此外，國內研究多使用2，4-D、ZT和6-BA等激素來誘導花生不定芽和體細胞胚，TDZ作為一種新型高效的植物生長調節劑，已受到越來越多研究者的關注，TDZ在花生遺傳轉化和再生體系中的作用亦有待于進一步研究。

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責任編輯 李占東 責任校對 李巖