東北虎圈養(yǎng)環(huán)境土壤中蛔蟲蟲卵的分離與鑒定

張長生　彭智偉　史沁欣　郝春曉　侯志軍

摘要 [目的] 對東北虎圈養(yǎng)環(huán)境土壤中蛔蟲蟲卵進(jìn)行分離與鑒定。[方法]對黑龍江某虎園內(nèi)的土壤進(jìn)行隨機采樣，對蛔蟲蟲卵進(jìn)行分離，通過形態(tài)學(xué)鑒定、分子生物學(xué)鑒定和分子進(jìn)化樹對其進(jìn)行鑒定。[結(jié)果] 通過形態(tài)學(xué)鑒定確定土壤中含有2種形態(tài)的蟲卵。分子生物學(xué)鑒定結(jié)果表明該蟲卵分別是是獅弓蛔蟲蟲卵和貓弓首蛔蟲蟲卵。分子進(jìn)化樹分析結(jié)果表明獅弓蛔蟲屬于弓蛔屬，貓弓首蛔蟲屬于弓首屬。[結(jié)論]通過形態(tài)學(xué)觀察、分子鑒定和進(jìn)化樹分析確定土壤中含有獅弓蛔蟲蟲卵和貓弓首蛔蟲蟲卵。

關(guān)鍵詞 東北虎；土壤；獅弓蛔蟲；貓弓首蛔蟲；分子生物學(xué)鑒定

中圖分類號 S85 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）11-127-02

蛔蟲病的流行極廣[1]，貓科動物蛔蟲病的病原體有弓首科弓首屬的貓弓首蛔蟲（Toxocara cati）和蛔科弓蛔屬的獅弓蛔蟲（Toxascaris leonina）。貓弓首蛔蟲是貓科動物常見的寄生蟲病。據(jù)調(diào)查貓弓首蛔蟲在貓科動物中感染率很高，為25.2%～66.2%[2]。蛔蟲病可導(dǎo)致動物營養(yǎng)不良、貧血、精神沉郁和生長發(fā)育受阻，幼小動物甚至死亡[3-5]。蛔蟲的發(fā)育主要分為蟲卵、幼蟲和成蟲。感染期是在蟲卵和幼蟲的階段。經(jīng)過4次蛻皮后進(jìn)入到成蟲期，蛻皮是蛔蟲發(fā)育過程中最顯著的特征之一。蛔蟲在幼蟲期是無增殖的。蟲卵是在外界土壤中發(fā)育的，而蟲體是在生物體內(nèi)寄生[6-8]。筆者對散養(yǎng)園內(nèi)的土壤進(jìn)行隨機采樣分析，通過形態(tài)學(xué)鑒定可判斷土壤中含有2種形態(tài)的蟲卵，通過分子生物學(xué)鑒定確定該蟲卵分別是獅弓蛔蟲蟲卵和貓弓首蛔蟲蟲卵，最后構(gòu)建進(jìn)化樹確定其分類地位。

1 材料與方法

1.1 樣品材料 土壤來自于黑龍江某虎園。

1.2 試劑 飽和硝酸鹽溶液、5%氫氧化鈉溶液、蛋白酶K、組織細(xì)胞基因組DNA快速提取試劑盒（原平皓生物技術(shù)有限公司）產(chǎn)品、rTaq酶、DNA Maker DL2000T（寶生物工程有限公司）產(chǎn)品；DNA膠回收試劑盒，為OMEGA公司產(chǎn)品。

1.3 鏡檢方法 采用飽和硝酸鈉漂浮法檢查土壤中蛔蟲卵[9]。

1.4 蟲卵DNA的提取 將保存的蟲卵液用研磨器研磨10 min后，加入20 μl蛋白酶K 37 ℃水浴過夜。使用組織細(xì)胞基因組DNA快速提取試劑盒提取DNA，-20 ℃下保存。

1.5 PCR引物設(shè)計 根據(jù)GenBank上貓弓首蛔蟲ITS-I序列隨即設(shè)計1對特異性引物，上游引物：5-GTGTTGAGGGGAAATGGGTGAC- 3，下游引物：5-CAATGTGCGTTCGAAATGTTAG -3，長度大約為414 bp。根據(jù)保守引物NC5/NC2對獅弓蛔蟲的整個ITS序列進(jìn)行擴增，上游引物NC5：5-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3； 下游引物NC2：5-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3。目的片段長度約為867 bp。

1.6 PCR反應(yīng) 采用25 μl PCR體系：10×PCR Buffer 2.5 μl、MgCl2 2 μl、dNTP 2.5 μl、上下游引物各1 μl、雙蒸水12 μl、Taq酶1 μl、模版3 μl。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性，5 min； 94 ℃變性30 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，72 ℃延伸10 min，32個循環(huán)。將PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳下進(jìn)行觀察。

1.7 擴增片段的克隆及篩選使用DNA膠回收試劑盒對擴增片段進(jìn)行純化，純化后產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中，振蕩培養(yǎng)后涂布在含Amp的LB上，過夜培養(yǎng)后挑選白色的單菌落，對菌落進(jìn)行PCR鑒定，篩選陽性克隆并進(jìn)行測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛔蟲蟲卵的形態(tài)結(jié)構(gòu) 在顯微鏡下觀察，獅弓蛔蟲蟲卵呈橢圓形，外有1層光滑的殼，呈黃褐色，大小為82.59 μm×64.54 μm。貓弓首蛔蟲蟲卵呈的蟲卵呈亞球形，卵殼凹凸不平，大小為66.18 μm×76.40 μm（圖1）。

2.2 PCR擴增結(jié)果 用保守引物NC5/NC2對獅弓蛔蟲進(jìn)行擴增，得到857 bp大小的片段（圖2）。特異性引物對貓弓首蛔蟲進(jìn)行擴增，得到416 bp大小的片段（圖3）。

2.3 獅弓蛔蟲和貓弓首蛔蟲的ITS-I序列比較結(jié)果使用MEG4.1生物軟件對獅弓蛔蟲和貓弓首蛔蟲的基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫上的其他蛔蟲的ITS-I序列建立系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，包括寄生在人和豬小腸內(nèi)的蛔蟲（Ascaris）； 寄生在貓、狗、狐、狼、獅等食肉動物體內(nèi)的弓蛔蟲（Toxocara）； 寄生在雞等家禽的禽蛔蟲（Ascaridia）； 寄生驢、馬的副蛔蟲

（Parascaris）； 寄生在蛙、蛇等兩棲、爬行動物的蛇蛔蟲（Ophidascaris）。遺傳進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，15種蛔蟲的ITS-1基因可大致分為2組。該試驗的獅弓蛔蟲屬于弓蛔屬，貓弓首蛔蟲屬于弓首屬。其中，貓弓首蛔蟲與馬來西亞弓首蛔蟲的親緣關(guān)系較近，同源性為98.3%；獅弓蛔蟲與貓弓首蛔蟲的同源性為80.5%（圖4）。

3 討論

蛔蟲生活史簡單，雌蟲產(chǎn)卵量大，蟲卵對外界環(huán)境的抵抗力強，如果用未經(jīng)處理的糞便施肥，糞便中的蛔蟲卵可能會廣泛污染土壤和周圍環(huán)境[10]。筆者對虎園散養(yǎng)圈內(nèi)所采的10份土樣進(jìn)行蟲卵形態(tài)學(xué)觀察，在其中1份中發(fā)現(xiàn)蛔蟲蟲卵，從形態(tài)學(xué)上初步鑒定為獅弓蛔蟲和貓弓首蛔蟲，同時又用分子方法進(jìn)一步證明確定所觀察到的蛔蟲蟲卵為獅弓蛔蟲和貓弓首蛔蟲，所得序列與GenBank已知的其他蛔蟲的序列進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，獅弓蛔蟲屬于弓蛔屬，貓弓首蛔蟲屬于弓首屬，隨機采取的土樣中蛔蟲蟲卵已經(jīng)不能用麥克馬斯特法測定其EPG值，僅能通過飽和硝酸鈉漂浮法檢測是否為陽性，說明土壤中蛔蟲卵的數(shù)量較少。

蛔蟲的感染會對東北虎的健康造成很大的影響，但在現(xiàn)有的條件下很難將東北虎蛔蟲病根治，只能將其感染率及感染強度降到最低。每次在群投驅(qū)蟲時，要更換不同的驅(qū)蟲藥，避免蛔蟲產(chǎn)生耐藥性，從而導(dǎo)致驅(qū)蟲藥失效。圈養(yǎng)東北虎要與散養(yǎng)東北虎隔絕開來，避免交叉感染。發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重食欲不振、消瘦的東北虎時應(yīng)特別注意，必要時要單獨進(jìn)行驅(qū)蟲。建議對園內(nèi)的動物進(jìn)行定期驅(qū)蟲，尤其是對象東北虎等感染較為嚴(yán)重的動物，可根據(jù)實際情況定期采集新鮮糞便送往實驗室檢查，根據(jù)感染程度制定相應(yīng)的驅(qū)蟲措施，以防止蛔蟲病的爆發(fā)[11]。

該研究結(jié)果不僅為研究獅弓蛔蟲和貓弓首蛔蟲的分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)生等奠定了基礎(chǔ)，而且亦為研究蛔蟲病是否與動物采食被感染性蟲卵污染的土壤、飼料和水提供理論借鑒。

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責(zé)任編輯 陳玉敏 責(zé)任校對 李巖