響應曲面法優化黑木耳多糖的硫酸化工藝研究

李婷婷 王振宇 尹紅力 劉冉 張乃珣

摘要 [目的] 優化黑木耳多糖的硫酸化工藝。[方法]用硫酸法對黑木耳多糖進行硫酸化修飾，用響應面法研究了修飾條件中反應時間（A）、反應溫度（B）和反應試劑配比（正丁醇∶濃硫酸）（C）3個因素對產物的硫酸基取代度的影響，并建立回歸模型，驗證其有效性。[結果]試驗表明，在反應溫度為-20～28 ℃、反應時間為0.5～2.5 h、反應試劑配比（正丁醇∶濃硫酸）為1∶2～1∶4范圍內，3個因素與產物平均取代度（Y）的回歸模型為Y=0.54-0.011A-0.008 8B- 0.017C+0.029A×B-0.044A×C +0.010B×C-0.11A2-0.021B2-0.13C2；F檢驗證明模型擬合較好，可以用于量化控制條件；3個因素對取代度的影響程度為C>A>B，并且各因素之間交互影響顯著。[結論] 對黑木耳多糖進行硫酸化修飾可提高其硫酸化程度，從而增加黑木耳多糖的生物活性。

關鍵詞 響應曲面；黑木耳多糖；硫酸化

中圖分類號 S509.9 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）11-263-04

硫酸化修飾是指通過化學的方法在多糖的結構中，引入硫酸根基團。多糖經過硫酸化后，在分子結構中引入了帶有負電荷的硫酸根基團，整個分子會顯示聚陰離子特性，可以阻斷病毒與機體細胞的吸附，從而增加天然多糖的多種生物學活性[1-2]。黑木耳是藥食同源真菌，屬真菌類擔子菌綱，主要分布在我國東北地區的大、小興安嶺。黑木耳不僅具有很高的營養價值，還具有多種藥理功能[3-4]。國內外文獻報道，黑木耳具有抗氧化[5-7]、降血脂[8]、降血糖[9]、抗腫瘤[10-11]和抗凝血[12-13]、抗菌[14]等活性，但多糖的水溶性差限制了其活性更好地發揮，而化學修飾可以提高多糖在水中的溶解度，增強其生物活性。

研究表明，硫酸化多糖的生物活性與硫酸化的程度有一定的關系[15]，筆者是通過用濃硫酸法對黑木耳多糖進行修飾，用響應曲面法對黑木耳多糖的硫酸化修飾進行工藝優化，以期達到提高其硫酸化程度，從而增加黑木耳多糖的生物活性。

1 材料與方法

1.1 材料 供試原料：黑木耳。主要試劑：氯化鋇、明膠、硫酸銨、氫氧化鈉、石油醚、無水乙醇、丙酮、正丁醇、濃硫酸、氯仿、三氯乙酸、鹽酸，均為分析純。主要儀器：

臺式離心機TDL-5，上海科興儀器有限公司；

722可見分光光度計，上海佑科儀器儀表有限公司；

旋轉蒸發儀R-205B，上海申勝儀器公司；

電熱恒溫水槽DK-8D型，上海一恒科技有限公司；

高速萬能粉碎機FJ-200，天津泰斯特儀器公司；電熱恒溫鼓風干燥箱DHG-9240，上海一恒科技有限公司；

電子天平YP200lN，上海精天電子儀器廠；漩渦混合器XW-80A，江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.2 黑木耳多糖的提取和精制

將黑木耳清洗干凈，置于烘箱中烘干，進行粉碎，過60目篩，使用石油醚將過篩后的黑木耳粉脫脂。以料液比1∶90 g/ml的比例，將脫脂后的黑木耳粉分別浸于純水中，在90 ℃下攪拌提取3 h，4 000 r/min離心15 min，收取上清液，殘渣重復提取3次，將提取液進行脫色處理，用3% H2O2 在50 ℃溫度下，保溫脫色2 h，使用saveg法除去蛋白，然后用流動水透析12 h，蒸餾水透析12 h，透析液用80%無水乙醇進行醇沉，沉淀物用丙酮、乙醚清洗除雜，將清洗后的沉淀物干燥至恒重，得到黑木耳多糖[16-17]。用苯酚-硫酸法測定糖含量為85.9%，考馬斯亮藍法測定其蛋白含量為1.3%。

1.3 單因素影響試驗 主要考察反應時間、反應溫度、反應試劑比例對硫酸化黑木耳多糖取代度的影響。

1.4 多糖硫酸化修飾響應面試驗設計

選取硫酸用量、反應溫度和反應時間3個因素，以所制備的黑木耳硫酸酯的硫酸基取代度（DS）為響應值，用Box-Behnken設計了3因素3水平試驗，根據單因素試驗，3個因素的水平值區間一般在如下范圍：溫度-20～28 ℃，反應時間0.5～2.5 h，反應試劑配比為1∶2～1∶4，同時考慮模型設計要求值須在中心點周圍對稱分布，故所取因素水平中心點為反應溫度4 ℃，反應時間1.5 h，反應試劑（正丁醇∶濃硫酸）配比1∶3，中心點和中心點兩側的水平取值代號0、1和-1表示（表1），3因素3水平共17個試驗。

1.5 黑木耳多糖硫酸酯化操作

按試驗設定的正丁醇和濃硫酸的體積比例，置于帶干燥和攪拌裝置的反應瓶中，再加入硫酸銨0.125 g，冰浴冷卻至0 ℃，攪拌30 min，緩慢加入多糖粉末0.5 g，放入特定的溫度下反應相應的時間。反應結束后用5 mol/L 氫氧化鈉調pH 8.0，混合溶液經透析，濃縮，冷凍干燥所得產物即為硫酸化黑木耳多糖[18]。

1.6 硫酸化黑木耳多糖取代度測定

用氯化鋇-明膠法。取1 mol/L HCl溶解K2SO4使其濃度為1.087 5 mg/ml，分別吸取該溶液0.02、0.06、0.10、0.14、0.16、0.18、0.20 ml，用1 mol/L HCl補足至0.2 ml，分別加入三氯乙酸3.8 ml，氯化鋇-明膠溶液1.0 ml和明膠溶液1.0 ml充分混合后室溫靜置15 min，用分光光度計測定混合液360 nm處的吸光值，記錄各組氯化鋇-明膠組與明膠組吸光值之差，以硫酸根濃度為橫坐標，差值為縱坐標繪制標準曲線。將樣品溶于1 mol/L HCl配成1 mg/ml的溶液，100 ℃水浴中水解4 h。取2份0.2 ml水解液，同法測定氯化鋇-明膠組和單一明膠組的吸光值，計算兩組之差。將測樣差值代入標準曲線，得樣品溶液中硫酸基濃度S%，S%除以樣品濃度（1 mg/ml）得固體樣品中硫酸基的質量分數S%[19-20]。取代度計算公式：

DS=（1.62×S%） /（32-1.02×S% ）。

1.7 回歸模型的建立

以17次試驗反應條件編碼值（A、B、C）為自變量，以產物的DS為響應值（Y），用Design-Expert軟件擬合多元回歸模型： Y=k0+k1×A+k2×B+k3×C+k4×A×B+k5×A×C+k6×B×C+k7×A2+k8×B2+k9×C2，求最佳k0～k9值，生成回歸方程。

1.8 回歸模型的參數分析

對回歸方程進行方差分析，將總方差變異來源拆分為回歸模型、失擬指數（lack of fit value）和純誤差3項。如果回歸模型未達到顯著水平（P>0.5），表示該模型不適合用來解釋和預測此試驗；如果失擬指數達到顯著水平（P<0.5），表示各試驗點實際值偏離理論值過大，擬合效果較差。

將方差分析結果中模型變異來源拆分成各因素及其交互項，根據F值判定其對響應值的影響是否顯著，及影響程度大小。將3個因素中的1個因素編碼值取0，得到其他2個因素對響應值影響的方程，作相應的三維曲面圖和等高線圖分析這種影響的變化趨勢，可得到顯著水平的交互效應。

1.9 回歸模型的有效驗證

將A、B、C分別取值為-1、0、1，在此條件下重復3次試驗，試驗結果用t檢驗判定是否與理論值相符。

2 結果與分析

2.1 反應時間對硫酸化黑木耳多糖取代度的影響

固定反應溫度為0 ℃，濃硫酸與正丁醇的比例為3∶1，選擇不同的反應時間，按硫酸化操作方法進行對黑木耳多糖的分子修飾。如圖1所示，反應時間在1 h時，取代度最可達0.47，時間越長，取代度反而下降。

2.2 反應溫度對硫酸化黑木耳多糖取代度的影響

固定反應時間為1 h，濃硫酸和正丁醇體積比3∶1，改變反應溫度，以測定其對黑木耳多糖硫酸化反應取代度的影響。由圖2所示，當反應溫度為4 ℃時，取代度較高，但隨著溫度的繼續提高，酯化產物的取代度明顯下降。所以低溫更加利于濃硫酸酯化反應。

2.3 反應試劑比例對硫酸化黑木耳多糖取代度的影響

固定反應時間為1 h，反應溫度為4 ℃，改變濃硫酸和正丁醇體積比，以考察不同反應試劑的比例對硫酸酯化取代度的影響。由圖3可知，硫酸酯產物的取代度隨著濃硫酸含量的增加呈先提高后下降的趨勢，而過高的濃硫酸含量會導致產物取代度的下降。

2.4 響應面試驗響應值 17次試驗結果見表2。

2.5 回歸模型

硫酸基平均取代度（Y）與反應時間（A）、反應溫度（B）、正丁醇∶濃硫酸（C） 3個因素編碼空間的多元回

歸方程：Y=0.54-0.011A-0.008 8B-0.017C+0.029A×B-0.044A×C+0.010B×C-0.11A2-0.021B2-0.13C2。

2.6 回歸模型的有效性 回歸模型的方差分析得出：F回歸模型=262.48，P回歸模式<0.0001；F失擬=4.42，P失擬=0.092 6。

由此可見，失擬指數P值為0.092 6大于0.05，表明回歸方程無失擬因素存在，回歸式擬合得較好。回歸方程顯著檢驗P值小于0.01，表明回歸方程達到極顯著，在試驗范圍內可以用來解釋和預測試驗結果。

2.7 回歸模型參數分析 回歸模型的參數估計值如下：F模型=262.48，P模型<0.000 1；FA=14.70，PA=0.006 4；FB=9.17，PB=0.019 2；FC=33.57，PC=0.000 7；FAB=49.35，PAB=0.000 2；FAC=114.59，PAC<0.000 1；FBC=6.24，PBC=0.041 1；FA2=822.32，PA2<0.000 1；FB2=1 129.50，PB2=0.001 2；FC2=27.22，PC2<0.000 1。

由此可見，模型中A、C、AB、AC、A2、B2、C2的P值均小于0.01，表明它們對黑木耳多糖硫酸化產物平均取代度有極顯著的影響，B、BC的P值均小于0.05，表明其對取代度影響顯著（P<0.05）。

同時，根據F值大小可推知，試劑比例對黑木耳多糖硫酸酯硫酸取代度的影響最大，其次是反應時間，最后是反應溫度，即試劑比例>反應時間>反應溫度。

利用Design Expert 7.0 軟件對二次回歸模型進行規范分析，得到反應時間、反應溫度、試劑比3 個因素之間的響應面立體分析圖及相應的等高線圖，見圖 4、5、6。預測最佳點為A=1.43，B=-1.48，C=1∶3.96，分別對應反應時間、反應溫度以及實際配比，以此估計響應值的理論值為0.539 5。

2.8 驗證試驗

由于實驗室條件限制采用優化條件反應溫度 4 ℃、反應時間1.4 h、 試劑配比為1∶4進行3 次平行試驗的取代度分別為0.520 2、0.509 7、0.521 1，平均為0.517 0，預測值與實際值接近。因此，通過響應面優化法得到的硫酸酯化黑木耳多糖的合成工藝可以用來指導實際生產。

3 結論

常用的多糖硫酸化方法有濃硫酸法、三氧化硫-吡啶法和氯磺酸-吡啶法，濃硫酸有低毒、操作方便、收率較高等優點，故該試驗采用濃硫酸法進行修飾。該試驗結果表明，采用濃硫酸法將黑木耳多糖進行硫酸化修飾切實可行。當反應時間和溫度一定，硫酸化多糖的取代度隨反應試劑中的濃硫酸與正丁醇的比例呈先升高后減少的趨勢，原因可能是由于增加了濃硫酸的用量，使黑木耳多糖降解。所以適當的濃硫酸與正丁醇的比例會使多糖充分獲得硫酸基。當其他條件不變，隨著反應溫度的升高，樣品的硫酸化取代度先升高后降低，原因可能是溫度升高有利于反應的進行，但在酸性條件下溫度過高會使靈芝多糖發生降解。因此，在單因素試驗和響應曲面設計的試驗結果的基礎上，確定黑木耳多糖硫酸化最佳的條件為：濃硫酸和正丁醇的體積比為1∶4，溫度為4 ℃，反應時間1.4 h，在此條件下，硫酸化產物取代度為0.517 0。

參考文獻

[1]

唐平，俞衛平，支明玉.黑木耳的開發研究進展[J].農產品加工（學刊），2012（5）：99-102.

[2] 申進文，王瑞瑞，許春平.秀珍菇多糖的硫酸化及其生物活性研究[J].河南農業科學，2014（7）：102-106.

[3] 陳煉，吳瓊英.多糖的結構修飾及其生物活性研究進展[J].農產品加工（學刊），2012（10）：103-106.

[4] 李小定，榮建華，吳謀成.真菌多糖生物活性研究進展[J].食用菌學報，2002（4）：50-58.

[5] FAN L S，ZHANG S H，YU L，et al.Evaluation of antioxidant property and quality of breads containing auricularia auricula polysaccharide flour[J].Food Chemistry，2007，101（3）：1158-1163.

[6] 趙永安，陳冠，陶遵威.苦豆子多糖及其衍生物的體外抗氧化活性[J].中國實驗方劑學雜志，2013（5）：229-232.

[7] 張麗霞，趙麗娟.金針菇多糖的抗氧化活性研究[J].西南農業學報，2014（1）：240-243.

[8] ACHARYA K，SAMUI K，RAI M，et al.Antioxidant and nitric oxide synthase activation properties of Auricularia auricular[J].Indian Journal of Experimental Biology，2004，42（5）：538-540.

[9] TAKEUCHI H，HE P，MOOI L Y.Reductive effect of hot-water extracts from woody ear （Auricularia auricula-judae Quel.） on food intake and blood glucose concentration in genetically diabetic KK-Ay mice[J].Journal of Nutritional Science and Vitaminology，2004，50（4）：300-304.

[10] MA Z C，WANG J G，ZHANG L N，et al.Evaluation of water soluble beta-d-glucan from auricularia auricular-judae as potential anti-tumor agent[J].Carbohydrate Polymers，2010，80（3）：977-983.

[11] 史寶軍，聶小華，許泓渝，等.灰樹花多糖硫酸酯的制備及其抗腫瘤活性[J].中國醫藥工業雜志，2003（8）：17-19.

[12] YOON S J，YU M A，PYUN Y R，et al.The nontoxic mushroom auricularia auricula contains a polysaccharide with anticoagulant activity mediated byantithrombin[J].Thrombosis Research，2003，3（112）：151-158.

[13] 張建榮，劉文廣，李永勝，等.類肝素寡糖/多糖衍生物抗凝血材料的研究進展[J].化工進展，2003（7）：699-702.

[14] 劉瑩，許琳，趙杰.金針菇多糖衍生物的制備及其抗菌性的測定[J].食品工業科技，2013（6）：137-139.

[15] 閆亞美，冉林武，劉蘭英，等.硫酸酯化多糖生物活性及其構效關系研究進展[J].安徽農業科學，2009（24）：11374-11375.

[16] 魏紅，吳向陽，仰榴青，等.黑木耳多糖的提取工藝[J].食品研究與開發，2010（5）：109-112.

[17] 陸雯，蔡振優，鮮喬，等.黑木耳多糖提取工藝條件的研究[J].中國食品添加劑，2010（6）：99-102.

[18] 申進文，馮雅嵐，余海尤，等.硫酸化分級香菇多糖抗氧化活性研究[J].菌物學報，2010（3）：449-453.

[19] 張帆，王德云，趙曉娜，等.響應面法探討氯磺酸-吡啶法修飾條件對硫酸化當歸多糖取代度的影響[J].天然產物研究與開發，2010（5）：830-835.

[20] 胡禮勇，張健，鄭波，等.牛膝多糖衍生物的幾種取代度測定方法的探討[J].天然產物研究與開發，2004（6）：491-495.

責任編輯 李菲菲 責任校對 李巖