流式細胞術在營養和食品衛生評價中的研究進展

李文華　胡茂志　嚴秋香　魏文嫻　崔桂友

摘要 流式細胞術作為單細胞水平上的分析技術，已逐漸被應用于食品科學研究領域，特別是在食品功能分析和食品生產與加工過程中的質量控制等方面呈現較好的應用前景。就其在食品功能成分評價與食品微生物檢測等方面的應用研究進展作一綜述。

關鍵詞 流式細胞術；食品功能成分；食品微生物

中圖分類號 S126文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2015）11-279-03

流式細胞術（flow cytometry，FCM）是20世紀60年代末發展起來的一項細胞分析技術，它集激光技術、光電測量技術、生物技術、計算機技術、流體力學以及熒光化學技術、單克隆抗體技術為一體，具有檢測速度快、測量參數多、采集數據量大、分選純度高、方法靈活等特點。流式細胞儀（flow cytometer）是應用FCM的有效工具，經過多年的不斷發展和改進，現已廣泛應用于各種基礎研究和臨床檢測[1]。在食品科學領域，隨著食品安全要求的提高，特別是在食品生產和加工過程中的質量控制以及食品功能成分評價等方面，FCM已成為一種重要的分析技術，呈現出較好的應用前景。筆者就其在營養與食品衛生評價方面的應用研究進展作一綜述。

1 流式細胞儀概述

流式細胞儀主要有4部分組成：流動室和液流系統、光源與光學系統、信號收集與信號轉換系統、計算機與分析系統。具有分選功能的流式細胞儀還包括分選系統。將待測細胞制成單細胞懸液，熒光標記后，在鞘液的包裹下單行排列，依次通過流動室的檢測區域。用激光垂直照射檢測區的細胞流，被熒光標記的細胞產生散射光和熒光，同時被前向光電二極管和側向90°方向的光電倍增管接收。前向散射光信號反映了細胞體積的相對大小，側向散射光信號反映了細胞內顆粒性物質的復雜程度。熒光信號代表了所標記的細胞表面或內部的分子信息，這些光信號被轉換成電信號，經A/D轉換器傳輸到微機處理器形成數據文件。細胞分選是將待測液滴充以電荷，讓其在高壓電場的作用下偏轉，落入不同的收集管中，從而實現細胞的分離[2]。在食品科學領域，FCM是單細胞水平分析的有力工具。目前，已涉及多種參數的檢測，包括細胞活性、核酸含量、細胞凋亡、酶活性、膜電位、細胞內pH測定等。

2 FCM在食品功能成分活性評價中的應用

食品功能成分對人體細胞作用機制的分析，為評價食品功能和開發新的功能性食品提供了依據，而FCM在其中發揮了重要作用。

2.1 增強免疫方面的評價

保健營養品酪蛋白糖巨肽（caseino-glycomacropeptide，CGMP）是κ-酪蛋白經凝乳酶和胃蛋白酶酶解后形成的含有64個氨基酸的不同種類肽段，具有多種生物學活性和獨特的營養特性，葉雷等用FCM研究了CGMP對小鼠腹腔免疫細胞及腸黏膜屏障的影響，發現CGMP可以增強小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬功能，誘導腸道黏膜免疫應答，增強腸黏膜免疫屏障功能，有望開發為抑制腸道炎癥的功能性食品添加劑。另外，他們還研究了CGMP對小鼠外周血T淋巴細胞亞群的影響，發現乳源CGMP能夠引起小鼠外周血T淋巴細胞亞群的變化，調節機體 T淋巴細胞亞群的平衡。這說明，CGMP可作為功能性食品對外周血T淋巴細胞亞群的失衡有緩解作用[3-4]。

n-3多不飽和脂肪酸食物主要包括α-亞麻酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸和二十二碳五烯酸。試驗和臨床研究表明，n-3多不飽和脂肪酸可以用于治療自身免疫和過敏性炎癥。Mukaro等運用FCM分析研究發現，長期食用富含n-3的食品，會降低NK細胞和中性粒細胞的碘化活性（iodination activity），提高淋巴細胞產生淋巴毒素的水平，從而降低炎性反應和組織損傷[5]。

2.2 抗氧化方面的評價

大豆異黃酮（Soy isoflavone，SI）是主要存在于豆科植物中的一類植物雌激素。近年來，大量的研究表明，SI的抗氧化效應介導了其廣泛的生物學效應，包括防治心血管疾病、更年期綜合癥、骨質疏松、乳腺癌和前列腺癌等疾病，是一類優良的天然抗氧化劑。染料木素（Genistein），又稱染料木黃酮、金雀異黃酮，是大豆異黃酮的一種。張婷用FCM研究證實，染料木素對氧化應激誘導的人臍帶靜脈內皮細胞活力下降和凋亡有保護作用，染料木素可濃度依賴的上調超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和GSH-Px的水平，并抑制氧化應激誘導的SOD、CAT和GSH-Px水平的降低，表明其對內源性抗氧化劑的上調是其抗氧化作用的重要機制之一[6]。

紅細胞膜病變是嚴重的糖尿病并發癥。研究表明，n-3脂肪酸能降低脂質過氧化作用，提高紅細胞膜中α-或γ-維生素E含量。Yang等利用FCM分析了紅細胞磷脂對稱性和膜脂肪酸的組成表明，富含n-3脂肪酸的麻子油可提高紅細胞的抗氧化能力，抑制高糖飲食引起的紅細胞脂質過氧化反應和膜變形[7]。

香菇多糖（Lentinan）是從香菇子實體中分離出的天然活性成分，因具有良好的抗腫瘤、抗病毒、調節機體免疫力和刺激干擾素形成等功效逐漸引起了人們的關注。Wang等用FCM分析了不同濃度香菇多糖喂養海參后的變化，發現一定濃度的香菇多糖刺激后會引起海參體腔細胞活力升高和吞噬作用明顯增強，同時也增加了體腔細胞內的CAT和堿性磷酸酶的活力[8]。

2.3 抗腫瘤方面的評價

人類飲食中廣泛存在黃酮類化合物，Chang等利用FCM等分析了23種黃酮對乳腺癌細胞（MDA-MB-231和MCF-7）、結腸直腸癌細胞（LoVo和DLD-1）和前列腺癌細胞（PC3）的毒性發現，它們誘導細胞凋亡的能力存在差異，其中，3，6-二羥基黃酮（3，6-dihydroxylflavone）最強，并推測其可以作為癌癥的化療藥物來開發[9]。

海帶多糖（Laminaria polysaccharide）是從海帶中提取的含有多種單糖和硫酸基的水溶性雜多糖，研究表明，海帶多糖具有抗腫瘤的效果。Ji等通過FCM分析了海帶多糖誘導人LoVo細胞凋亡的機制，發現海帶多糖通過增強機體的免疫功能而間接抑制或殺死腫瘤細胞。它不僅能激活巨噬細胞和T細胞等免疫細胞，還能促進白細胞介素、腫瘤壞死因子等細胞因子的生成，從多個方面抑制腫瘤細胞的生長擴散[10]。

白藜蘆醇（resveratrol）是一種由植物產生的多酚類物質，主要存在于紅葡萄皮、豌豆、堅果、藍莓、桑椹、蔓越莓、姜黃和菠菜等植物組織中。阿薩通過FCM分析細胞中GSH-Px等抗氧化酶的活性發現，白藜蘆醇可通過調節GSH-Px、CAT和SOD等抗氧化酶來達到抗腫瘤的效果[11]。

2.4 其他方面的評價

腸促胰素是人體內一種腸源性激素，在進食后，該類激素可促進胰島素分泌，發揮葡萄糖濃度依賴性降糖作用。腸促胰素主要是由GLP-1（glucagon-like peptide-1）和GIP（glucose-dependent insulinotropic peptide）組成，其中GLP-1對2型糖尿病的發生發展具有較大影響。Gonzalez-Abuin等通過FCM分析了葡萄籽原花青素提取物對腸道內分泌細胞（STC-1）的影響，發現一定濃度的葡萄籽原花青素提取物可通過促進STC-1細胞分泌GLP-1來調節體內葡萄糖平衡[12]。

高脂肪飲食會引起內皮細胞功能障礙，從而可能會導致動脈粥樣硬化，而循環微粒子（circulating microparticles，MPs）和內皮祖細胞（endothelial progenitor cells）在高脂肪飲食后對內皮細胞影響較大。Bulut等通過FCM分析了成人在高脂肪飲食后飲用礦泉水、可樂、紅酒以及白酒的影響，發現飲用可樂組MPs大量增加（增加了62%），而紅酒組MPs增加量最?。ㄔ黾?%），因此認為，高脂肪飲食后飲用少量紅酒可減少對機體的危害[13]。

食物過敏可引起皮膚、消化、呼吸和神經系統等多個系統的過敏癥狀并造成損害。中藥復方Formula-2（FAHF -2）由靈芝、干姜、黃柏、桂枝、川椒、烏梅、人參、當歸和黃連9 種中藥組成，被證明是安全有效的治療食物過敏的中藥。 Patil等用FCM分析了FAHF-2的作用機理，發現其可有效緩解食物過敏引起的嗜堿性粒細胞和嗜酸性粒細胞升高[14]。

此外，FCM還可應用于臨床上兒童對牛奶的免疫耐受評價、食品添加劑的細胞毒性評價、黃酮類化合物的藥理潛能評價等，為保健食品和醫藥品的分析提供了科學依據。

3 FCM在食品微生物檢測方面的應用

FCM發展于20世紀60年代，并迅速用于醫學領域分析哺乳動物細胞，在20世紀70年代后期開始用于微生物領域，但因微生物細胞體積比哺乳動物細胞小，限制了微生物檢測方面的應用。1990年，FCM首次應用于酒類釀造。之后，被廣泛運用于面包發酵、釀酒等行業，并逐漸用于其他食品和飲料行業[15]。目前，在食品工業中，FCM已經成為微生物檢測的常用工具。

3.1 細菌活性判斷方面的應用

結合細菌活性染料，FCM可以實現對活菌的檢測。通過熒光信號的強弱或有無可知菌體活性的大小或有無，并且該方法可以檢測低活性的細胞，而如果使用傳統的培養法或亞甲基藍染色法檢測低活性細胞，則誤差較大。Schenk等分析紫外線照射對大腸桿菌ATCC11229、無害李斯特菌ATCC33090和釀酒酵母KE162的損傷發現，隨著紫外曝光的時間不同，細胞損傷程度也不同。短時間內，大腸桿菌和釀酒酵母的PI陽性率增加，而無害李斯特菌由于膜破裂而全部被殺死[16]。葉雷等利用熒光染料標記直投式發酵劑菌體細胞，分析了細菌的活力以及生存狀態[17]，這對科學評價各種微生物發酵劑的品質具有現實意義。

3.2 食品微生物的在線監測

食品的生產一般是一個連續的流水線過程，最終產品是否合格依賴于各環節的質量保證，這就是實時監測的意義所在。Broger等設計出一種低通量FCM檢測系統（Flow injection flow cytometry），用于實時、在線監測生物反應器中菌體生長的變化過程。通過與其他熒光檢測方法比較發現，只有FCM可以從大量弱熒光信號的菌體中辨別出少量熒光信號強的菌體。并且發現，在菌體培養過程中，個體之間的異質性明顯。因為菌群中菌體信號分散在一個較寬的范圍內，因此設想，可以從中選擇高產量、穩定的菌株[15，18]。由以上可知，該技術在產品實時監測方面具有傳統方法無法比擬的特點。

3.3 益生菌方面的應用

益生菌（probiotics）是指一類自然存在的有益宿主的微生物。它們可促進機體腸道微生態平衡、增強機體免疫功能，最終達到提高抗病力和促生長等益生作用。Geng等用FCM分析了4種商業乳制品中活的雙歧桿菌含量，檢測結果與傳統培養檢測方法相一致，但相較于傳統方法需72 h，FCM檢測方法僅在2 h內即可得到檢測結果，大大縮減了檢測時間[19]。Chen等用FCM方法檢測了乳酸菌DPC16對不同壓力的抵抗力，發現DPC16具有較強的耐酸性；另外，相較于其他糖類，乳糖可較好地保持凍干法處理后的DPC16的活性[20]。

3.4 食源性致病菌的檢測

食品生產、運輸、消費過程中的微生物污染造成的食源性疾病是食品安全中最突出的問題，盡管近年來人們不斷加強衛生監管，致病菌污染食品的案例仍屢屢發生。FCM與免疫熒光抗體標記技術相結合，通過檢測病原菌表面的特征性抗原，而特異性檢測食源性致病菌。目前，該技術已成功地應用于沙門菌（Salmonella）、大腸桿菌、嗜肺軍團菌（Legionella pneumophila）、單核細胞增生性李斯特菌（L.monocytogenes）等病原菌的檢測。并且，將染料之間的熒光能量共振轉移效應與免疫熒光方法相結合，可以在一定程度上減小抗體的非特異性吸附，從而提高檢測靈敏度[21]。

4 小結與展望

在食品和飲料行業，進行傳統常規檢測會大大延誤產品上市時間，而流式細胞術與傳統檢測技術相比，具有檢測速度快、收集數據量大、分析全面、方法靈活、重復性好等優點，目前已成為食品生產和加工過程中質量檢測的一種較好的方法。雖然流式細胞術應用于食品行業具有諸多優點，但該方法的推廣還是存在一些問題，如流式細胞儀價格昂貴，檢測用微球和熒光染料成本較高，樣品前處理復雜等。針對這些問題，期望在今后流式細胞儀的發展過程中，可以研制出價格低廉的試劑，優化樣品前處理技術，同時使檢測設備更便捷、易操作。相信在不久的將來，流式細胞術會更廣泛地應用于食品行業。

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