豬圓環病毒的研究進展（續完）

摘 要：隨著人們對微量元素營養研究的不斷深入，其營養作用越來越被重視，本文綜述了微量元素鋅在豬體內的分布、生理代謝及營養作用。

關鍵詞：鋅；分布；代謝；作用

4 診斷

4.1 病毒抗原檢測技術

4.1.1 間接免疫熒光試驗

該法是一種比較特異的血清學診斷方法。將病料接種PK15細胞，用兔抗高免血清與細胞培養物反應，可對PCV進行檢測和定性。Allan等利用間接免疫熒光法來檢測PCV-2，將組織病料以蓋玻片在PK15細胞上培養，丙酮固定，用兔抗PCV-2高免血清與細胞培養物中的PCV-2反應，對PCV-2進行檢測和分型。

4.1.2 核酸探針及原位雜交技術

原位雜交是應用已知堿基順序并帶有標記物的核酸探針與組織、細胞中待檢測的核酸按堿基配對的原則進行特異性結合而形成雜交體，然后再應用與標記物相應的檢測系統，通過組織化學或免疫組織化學方法在被檢測的核酸原位形成帶顏色的雜交信號，在顯微鏡或電子顯微鏡下進行細胞內定位。Kim等針對PCV-1（ORF1）的349 bp特異DNA片段和PCV-2（ORF2）的481 bp特異DNA片段，借助于PCR技術獲得這兩個目的片段，進行地高辛標記，然后用于原位雜交，從福爾馬林固定、石蠟包埋的組織中檢測病毒的DNA。原位雜交技術是結合病理學技術和免疫學技術而進行的，其檢測靈敏度較高，而且能夠精確定位，但其操作復雜，并需要專業的人員，它的應用受到了極大的限制。

4.1.3 PCR診斷技術

PCR技術以其敏感、特異、快速、準確的優點成為目前病毒學診斷、分子生物學實驗最常用的技術之一，它也是在PCV的病原檢測和定型中最常用的技術。目前，國內外已經建立了多種檢測PCV-1與PCV-2的PCR技術。

王憲文等建立快速、簡便、特異的檢測豬圓環病毒II型的PCR方法，根據已發表的豬圓環病毒II型基因序列設計合成了一對引物，應用PCR技術對豬圓環病毒進行基因擴增，PCR產物進行序列測定，以豬瘟病毒、豬偽狂犬病毒、豬細小病毒為對照，進行特異性試驗，取部分病料進行重復性試驗。結果PCR方法擴增出了長度為702 bp的片段，擴增產物經測序和序列分析表明擴增的序列為PCV-2序列；豬瘟病毒、豬偽狂犬病毒、豬細小病毒的PCR擴增均為陰性。呂艷麗等根據PCV-2的基因序列設計一對特異的PCR引物進行PCR檢測，建立了特異的PCR診斷方法。該方法可以檢測細胞和組織中的病毒核酸。

Ouar dani等根據已發表的PCV-2和PCV-1基因序列設計了兩套引物，一套中的一對引物針對PCV-1和PCV-2的ORF2基因序列可擴增出488 bp的目的條帶，另一對引物針對PCV-1的ORF1基因能擴增出375 bp的基因片段，而對PCV2的ORF1不能擴增；另一套中的一對引物針對PCV-1和PCV-2的ORF1基因序列均可擴增出646 bp的目的條帶，另一對引物只對PCV-1的ORF2基因能擴增出425 bp的目的條帶，而不能擴增PCV-2的ORF2基因，從而能夠很好地區分PCV-1和PCV-2的感染。

王貴平等根據GenBank登錄的豬圓環病毒2 型（PCV-2）的全基因組序列，設計了2對引物，建立了檢測PCV-2的套式PCR方法。對該方法用序列分析、酶切等方法進行了鑒定。同時用該套式PCR方法對華南地區287個豬場的1 560份樣品進行了檢測，結果，983份為PCV-2陽性，陽性率為63 %。Kim等運用多重套式PCR來同時檢測PCV-1、PCV-2及PPV，并同原位雜交法進行了比較。結果發現，兩種方法的檢出率均為100 %，因而證實了該法可以成功地同時檢測上述三種病毒。

Chung等建立了實時定量PCR方法用于PRRSV c DNA和PCV-2 DNA的定量檢測，應用該方法對自然感染豬和攻毒豬的PRRSV和PCV-2在肺、脾、扁桃體及淋巴器官中的分布和定量進行了研究，結果表明，PRRSV和PCV-2病毒載量分別5.73～8.38和5.65～6.91（拷貝數/mg）。已建立的定量PCR方法可能是將來疫苗研制和發病機理研究的有用工具.

Fenaux M等先以PCR快速而有效地擴增微量的豬圓環病毒DNA，然后再利用RELP區分PCV1和PCV2，以此來進行豬圓環病毒的檢測和定型。他們根據PCV1和PCV2的243 bp片段，利用僅在PCV2上有的限制性酶切片段位點NcoI來鑒定PCV1和PCV2。PCV2的PCR產物可被NcoI切成168 bp和75 bp的兩個片段，而在PCV1的PCR產物上則無NcoI的位點，所以不能被NcoI切割，這樣就可以直接區分PCV1和PCV2了。

4.1.4 核酸環介導等溫擴增（LAMP）技術

LAMP在保持PCR技術優點的基礎上，進一步增強了反應的特異性和縮短了檢測時間。陳豪泰等利用LAMP技術針對豬圓環病毒II型的cap基因進行檢測，檢測結果表明該方法較常規PcR方法敏感，最低檢出限僅為5個拷貝數。

4.2 病毒抗體檢測技術

ELISA方法是目前檢測PCV-2病毒抗體最常用有的方法，郎洪武等用加拿大PCV-2克隆化特異性表達抗原陽性血清、陰性血清，按常規ELISA法進行斷奶仔豬多系統衰弱綜合征抗體檢測，被檢血清以1∶400稀釋，陽性和陰性對照血清以1∶100稀釋，當被檢樣品的OD值≥3倍陽性對照OD值時判為陽性，否則為陰性。該法靈敏度較高。崔尚金等采用PCV抗原和正常細胞對照抗原，建立了間接ELISA，并被農業部推薦為進行流行病學調查的方法。Walker等首次利用PCV-1和PCV-2特異性單克隆抗體建立了競爭ELISA方法來檢測PCV22抗體，并將該方法和間接免疫熒光方法相比較，對來自英國、加拿大和法國的484份感染PCV-2的豬血清的檢測結果表明，競爭ELISA方法的檢出率為99.58 %，而間接免疫熒光的檢出率僅為97.14 %。張志慧等采用IPMA法標定不同PCV-2抗體效價的陽標準陽性血清50份和標準陰性血清30份，對5種PCV-2-ELISA抗體檢測試劑盒的敏感性、特異性及符合率進行平行檢測，結果顯示，這5種試劑盒的敏感性為74.0 %～96.0 %，特異性為83.3 %～96.7 %，符合率為77.5 %～96.3 %，其中以國產阻斷ELISA試劑盒和Ingenasa公司的試劑盒效果最好。此外，本研究采用國產阻斷ELISA試劑盒對PCV-2疫苗免疫豬血清抗體檢測表明，疫苗免疫21 d后抗體陽性率達50 %，免疫28 d抗體陽性率達100 %；對PCV-2人工感染豬血清抗體檢測顯示，病毒接種后第28 d抗體陽性率為30.0 %，第42天陽性率為100 %；對臨床送檢豬血清抗體檢測表明，PCV-2抗體陽性率介于45.0 %～76.5 %。本研究通過對PCV-2五種抗體檢測試劑盒的比較及應用顯示，國產阻斷ELISA試劑盒可以作為檢測PCV-2疫苗免疫及臨床感染豬血清抗體的有效方法。

5 疫苗

PCV-2是一種豬疾病綜合征的病原體，這種疾病綜合征在歐洲被稱為豬圓環病毒病（PCVD），在美國被稱為豬圓環病毒相關疾病（PCVAD），在世界上養豬業比較發達的國家，PCV-2被認為是給養豬業帶來損失最多的病原體之一。疫苗免疫接種是防控PCVD的有效手段，國內外學者在PCV-2疫苗研究方面開展了大量研究。

5.1 現有商品化疫苗

2004年，第一個商品化的PCV-2疫苗在法國和德國面世。目前市場上用于預防豬群中PCVAD發生的商品化疫苗一共有7種，分別由Meriall、Boehringer Ingelheim、ntervet、Schering-Plough、Pfize、上海海利和南農高科7家公司生產，其中滅活疫苗三種、亞單位疫苗三種、嵌合疫苗一種，在對照攻毒試驗中，市售PCV-2疫苗的效果已得到了廣泛的檢驗，證明這些商品化疫苗在對抗PCV-2感染時具有良好效果。為有效防控PCV-2感染發揮了重要作用。

5.2 正在開發疫苗

現在市面上的商品化PCV-2疫苗大部分都是基于PCV-2a基因型的，而且效果確實，但是現在世界范圍內豬群PCV-2的主要流行亞型是PCV-2b基因型。此外，在PCV2活載體疫苗、核酸疫苗及標記疫苗等新型基因工程疫苗的研究方面也取得了突破性進展，也有望實現商品化。

5.2.1 嵌合疫苗

近年來已至少鑒別出了3種有明顯區別的PCV-2基因型，PCV-2a、PCV-2b和PCV-2c。PCV-2a和PCV-2b都不同程度的與PCVAD的發生相關；PCV一2c僅在丹麥的一些無臨床癥狀的豬群中有過報道，目前一些流行病學方面的研究表明，自然感染PCV-2的豬群中流行亞型是PCV-2b，且PCV-2b的毒力似乎比PCV-2a更強一些，因此，也有人用PCV-2b的ORF2替換PCV-1的ORF2，包裝出了一種新的嵌合病毒。這種嵌合病毒在動物體內是減毒的，能夠誘導機體產生免疫保護，并且可以產生對PCV-2a的交叉保護。

5.2.2 DNA疫苗

研究證實，含PCV-2 ORF2基因的質粒載體（pORF2）能誘導仔豬產生抗PCV-2感染的保護性免疫應答，Fenaux等用PCVl-2嵌合病毒DNA疫苗免疫仔豬，免疫后42 d，檢測到大部分仔豬PCV-2抗體陽轉，攻毒后21 d，對照組仔豬出現病毒血癥，淋巴結腫大，淋巴組織衰竭等癥狀，而免疫組仔豬未出現病毒血癥，淋巴組織損傷程度較輕，淋巴組織的病毒載量顯著降低，表明PCVl—2嵌合病毒DNA疫苗可以有效預防PCV-2感染。目前，盡管DNA疫苗具有諸多優點，但外源基因在體內的表達調控及其在體細胞中的轉移可能會產生意外的免疫病理反應等瓶頸問題，使得些DNA疫苗的前景還不甚明朗。

5.2.3 活載體疫苗

腺病毒作為基因轉移載體已廣泛應用于基因工程疫苗研發，Wang等成功構建了表達PCV-2 ORF2基因的重組腺病毒rAd-Cap，然后通過動物免疫保護試驗評價rAd-Cap對仔豬的免疫保護效果，結果發現，在首免后37 d即能檢測到抗PCV-2的高水平ELISA抗體和病毒中和抗體，免疫仔豬的相對日增體質量率顯著高于攻毒對照組，而組織損傷程度和病毒血癥的發生率卻明顯低于攻毒對照組。偽狂犬病也是一種重要的豬病，經常與圓環病毒合并感染。有報道稱用偽狂犬病病毒（PRV）作為活病毒疫苗載體的研究工作中取得突破性進展，Ju等成功構建了表達PCV2 ORFl-ORF2融合蛋白的重組偽狂犬病毒PRV-PCV2，Western blot試驗證實ORFl-ORF2融合蛋白在重組病毒中正確表達，用PRV-PCV2免疫小鼠后，能在小鼠體內誘導產生抗PRV和PCV-2的特異性抗體，保護小鼠抵抗PRVEa強毒株攻擊；而且，仔豬免疫試驗也證實PRV-PCV-2能誘導仔豬產生針對PRV和PCV2的特異性免疫應答。與重組腺病毒對比，重組偽狂犬病毒能在豬體內很好地繁殖，因此，在PRV-PCV2二聯活載體疫苗研制方面具有巨大的潛力和應用價值。Pei等在豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）cDNA克隆的ORFs1b與2a之問插入2個限制性酶切位點和1個轉錄調控序列TRS6，將其改造成一個通用的病毒載體，然后將PCV-2 ORF2基因插入2個限制性酶切位點之間，由TRS6啟動轉錄，構建了表達Cap蛋白的重組質粒，用重組質粒轉染Marc-145細胞成功獲得了P129-PCV重組PRRSV。動物免疫試驗證實：免疫5周后，在P129-PCV免疫的豬體內能誘導產生抗PCV2特異性抗體應答。

此外，還有以將病原體的保護性抗原與噬菌體的外殼蛋白以融合蛋白形式展示于噬菌體的表面，構建的表達外源抗原的噬菌體載體疫苗；用乳酸球菌作為遞呈載體來表達PCV-2 Cap蛋白從而制備口服疫苗；還有以大腸桿菌、博德特氏菌以及酵母作為載體進行活載體疫苗研究的報道。

5.2.4 標記疫苗

標記疫苗是指應用DNA重組技術將分子標記插入病毒基因組中而研制的一類新型的重組疫苗，該類疫苗毒株可與野毒株相區別。有報道稱PCV-2基因組cap基因的C端至少容許插入27個氨基酸，而且插入后的氨基酸剛好是暴露在病毒粒子表面而形成新穎抗原表位。減毒活嵌合PCVl-2a病毒能展示短抗原表位標簽，從而誘導感染豬產生抗PCV-2抗體和抗表位標簽抗體，從而給后續的特異性抗體檢測帶來便利。Beach等將GLU或KT3標簽定向克隆至PCVl-2嵌合病毒Cap蛋白的C末端，成功構建了2種帶分子標記的PCVl-2嵌合病毒，并證實其能在PKl5細胞上增殖，試驗感染豬后能在血清中檢測到PCV-2中和抗體和抗GLU或KT3標簽的特異性抗體，為臨床區分PCV2自然感染和疫苗免疫奠定了堅實的基礎。

豬圓環病毒病是近年來阻礙養豬業發展的重要傳染病，目前，豬圓環病毒病已成為當今的研究熱點，也取得了不小的進展，相信隨著對病毒的病原特性、疾病的發病機理、動物的免疫保護機制以及病毒感染的流行病學特點等的深入研究，將一定會建立更加快速靈敏的檢測方法，研制更加安全高效的新型疫苗，從而控制PCV-2的流行，減少養豬業的損失。