不同提取方法對黃連中小檗堿含量的影響

【摘 要】本實驗對不同提取方法對黃連中小檗堿含量的影響進行研究。方法：采用奧泰公司C18色譜柱（220mm×4.6mm，5μm），甲醇-乙腈-水-磷酸-三乙胺（15∶15：70：0.05：0.1）為流動相，檢測波長為265nm，流速為1.0ml/min，柱溫為30℃。小檗堿在0.05～0.55mg·mL-1范圍內呈良好的線性關系（r=0.99995）。小檗堿平均回收率分別為99.5%。結論：本法簡便、準確，可用于黃連中小檗堿的含量測定。實驗結果表明回流法、超聲法、回流超聲法三種提取方法間均有顯著性差異。

【關鍵詞】小檗堿；含量；測定

黃連，多年生草本植物，屬毛莨科黃連屬。黃連始載于《神農本草經》，列為上品，因其根莖呈連珠狀而色黃，所以稱之為“黃連”。《新修本草》記載：“蜀道者粗大節平，味極濃苦，療渴為最；江東者節如連珠，療痢大善。今澧州（今湖南澧縣）者更勝。”黃連具有清熱燥濕，瀉火解毒的功效。黃連常用于濕熱痞滿、瀉痢、黃疸、心火亢盛、血熱吐衄、牙痛、癰腫疔瘡、濕瘡等。黃連含有黃連素（Berberine）、木蘭花堿（Magnoflorine）、黃連堿（Coptisine）、甲基黃連堿（Worenine）、黃柏內酯（Obakulactone）、非洲防己堿（Columbamine）、阿魏酸（Ferulic acid）等。本實驗對不同提取方法對黃連中小檗堿含量的影響進行研究。

1.儀器與試藥

（1）儀器：ULABO實驗室溫度控制器（優萊博技術（北京）有限公司）；SCQ-25-6聲彥分體式超聲波清洗機（上海聲彥超聲波儀器有限公司）；海能儀器LC7300 HPLC一體等度系統（濟南海能儀器股份有限公司）；CPX2800H-C必能信超聲波清洗器（必能信超聲（上海）有限公司）；SP-1920雙光束紫外-可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司）；Precisa EP8200C 電子精密天平（上海精科天美科學儀器有限公司）；XSYF-D實驗室廢水處理設備（北京湘順源科技有限公司）。

（2）色譜柱：奧泰公司C18色譜柱（220mm×4.6mm，5μm）。

（3）對照品：小檗堿

（4）試劑：甲醇（西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司）、醋酸鈉（上海泰坦科技股份有限公司）、磷酸二氫銨（阿拉丁試劑（上海）有限公司）、冰醋酸（阿拉丁試劑（上海）有限公司）、三乙胺（上海一基生物試劑有限公司）、庚烷磺酸鈉（上海一基生物試劑有限公司）、乙腈（西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司）。

（5）試藥：黃連

2.測定方法確定

2.1色譜條件

依據查閱文獻及考查的結果，確定色譜條件如下[1-5]。流動相：甲醇-乙腈-水-磷酸-三乙胺（15∶15：70：0.05：0.1）為流動相，檢測波長：265nm，流速：1.0m·min-1。柱溫：30℃。理論板數按小檗堿峰計算應不得低于2000。

2.2對照品溶液的制備

精密稱取小檗堿對照品適量，置容量瓶中，加流動相制成每1mL含0.1mg的溶液，即得。

2.3供試品溶液的制備

2.3.1回流法

將黃連粉碎，過40目，稱取適量，置圓底燒瓶中，精密加入1%鹽酸甲醛溶液50mL，精密稱定重量，加熱回流40分鐘，放冷，精密稱定，用1%鹽酸甲醛溶液補足重量，搖勻，濾過。取續濾液，即得。

2.3.2超聲法

將黃連粉碎，過40目，稱取適量，置具塞錐形瓶中，精密加入1%鹽酸甲醛溶液20mL，密塞，精密稱定重量，超聲處理20分鐘，放冷，精密稱定，用1%鹽酸甲醛溶液補足重量，搖勻，濾過。取續濾液，即得。

2.3.3回流超聲法

將黃連粉碎，過40目，稱取適量，置圓底燒瓶中，精密加入1%鹽酸甲醛溶液50mL，精密稱定重量，加熱回流20分鐘，放涼，再超聲處理20分鐘，放冷，精密稱定，用1%鹽酸甲醛溶液補足重量，搖勻，濾過。取續濾液，即得。

2.4精密度試驗

精密稱取小檗堿對照品適量，加流動相使溶解，制成濃度為0.1mg·mL-1的供試品溶液。照上述色譜條件，精密吸取10μl，連續進樣6次，記錄峰面積。結果，RSD=0.66%，表明本方法精密度良好。

2.5對照品的線性考察

精密稱取適量小檗堿對照品，加入流動相溶液使溶解分別配制成每毫升含0.05、0.1、0.15、0.25、0.35、0.4.、0.45、0.55毫克的溶液。分別精密上述溶液吸取10μL，注人液相色譜儀，依照2.1項下的色譜條件測定，記錄色譜峰。以峰面積（Y）為縱坐標，對照品進樣量（X）為橫坐標，繪制標準曲線。結果表明，小檗堿在0.05～0.55mg·mL-1范圍內呈良好的線性關系。

2.6重現性試驗

稱取同一批的小檗堿樣品6份，按測定方法項下的方法制備供試品溶液，測定含量，并計算樣品的RSD值，結果RSD為0.65%，結果表明此方法的重現性良好。

2.7準確度試驗

取對照品適量，精密稱取已知含量的樣品9份，置量瓶中，分別精密加入小檗堿對照品，按項下方法制備成80%100%、120%。取模擬樣品照“ 含量測定” 項下方法試驗，計算回收率為99.5%，RSD為0.65%。

2.8樣品含量測定

依照上述含量測定方法，再按外標法以峰面積計算樣品的含量，結果回流法、超聲法、回流超聲法三種方法提取方法所提樣品的含量分別為7.51%、7.53%、7.53%。實驗結果表明回流法、超聲法、回流超聲法三種提取方法間均有顯著性差異。

3.討論

分別考察0.04mol·L-1磷酸二氫銨溶液-乙腈-三乙胺（60∶40：0.01），甲醇-1%冰醋酸溶液（28∶72），甲醇-乙腈-水-磷酸-三乙胺（15∶20：60：0.05：0.1），甲醇-0.01mol/L醋酸鈉溶液-0.04mol/L庚烷磺酸鈉-冰醋酸-三乙胺（20∶40：40：0.01：0.01），甲醇-水-冰醋酸（33∶66∶1），甲醇-乙腈-水-磷酸-三乙胺（15∶15：70：0.05：0.1）不同比例的流動相，結果以甲醇-乙腈-水-磷酸-三乙胺（15∶15：70：0.05：0.1）為流動相為流動相，供試品各峰分離效果最好，故選用甲醇-乙腈-水-磷酸-三乙胺（15∶15：70：0.05：0.1）為流動相為流動相。本實驗采用高效液相法效果好、方法簡便、快捷、準確、專屬性好，可用于黃連中小檗堿的含量測定。實驗結果表明回流法、超聲法、回流超聲法三種提取方法間均有顯著性差異。

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