綠香椿組織培養外植體褐變現象的研究

摘 要：以綠香椿頂芽為外植體，對其組織培養過程褐化的發生及預防進行研究，結果表明：不同消毒劑處理的頂芽褐化率不同，其中褐化率最低的是0.1%HgCl2；在培養基中分別添加活性炭（AC）、抗壞血酸（VC）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）3中防褐化劑，效果最好的是1g/L聚乙烯吡咯烷酮。

關鍵詞：香椿；組織培養；褐變

中圖分類號 S644.4 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2015）22-37-02

香椿（Toona sinensis）別名紅香椿、香椿頭、椿甜樹、香椿芽、椿陽樹、香椿樹等，香椿屬，多年生木本植物。香椿的食用價值、藥用價值表現突出，而隨著香椿芽食藥用價值研究的深入[1]，作為我國唯一木本蔬菜，市場上興起了一股香椿熱潮，大棚、溫室等保護地設施也被廣泛利用，香椿芽周年栽培技術逐漸成熟，并且將此技術逐漸推廣開來[2-3]。由于常規的種子繁殖、扦插育苗、分蘗繁殖等存在諸多問題，難以滿足市場對香椿種苗的大規模需求，因此，植物組織培養已成為一種重要的繁殖途徑，但香椿初代培養過程存在較嚴重的褐化現象，嚴重影響了優質香椿種苗的快速生產。筆者選擇本地大棚栽培的綠香椿頂芽為外植體，研究綠香椿組織培養過程中防褐化最佳條件，為香椿工廠化生產種苗提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料來源 香椿頂芽來自于河南省農科院在河南省高新科技園區的香椿苗圃，苗齡3a的綠香椿。

1.2 材料處理與消毒 香椿頂芽于4月中旬采集。材料采回后，先用流水沖洗30min，再用洗潔精水浸泡3min，并用軟毛刷輕輕刷洗表面，最后用流水沖洗干凈，在無菌條件下進行消毒。將材料分成4份，先用75%的酒精浸泡30～60s，再分別用0.1%升汞（HgCl2）、2%次氯酸鈉（NaClO）、10%過氧化氫（H2O2）、1%硝酸銀（AgNO3）進行消毒處理，最后用無菌水沖洗3～5遍。接種前用無菌吸水紙吸干材料表面的水分，將材料有切口的部位切除少許，剪成1.5～2cm的莖段，快速接種到培養基中。

1.3 不同添加物處理對外植體褐化的影響 外植體的處理同1.2，消毒劑選擇0.1%HgCl2處理10min。培養基中分別添加活性炭（AC）（160目[4]）、抗壞血酸（VC）和聚乙烯吡咯烷酮（PVP），設計不同的試驗處理，以不添加任何吸附劑和抗氧化劑的處理為對照。

1.4 培養基和培養條件 基本培養基均采用MS+6-BA O.5mg/L+GA3 1.0mg/L，加入蔗糖30g/L，瓊脂7g/L，培養基pH5.8～6.0，培養基均添加20mg/L的四環素[5]。培養溫度為23～28℃，光照強度1 000～1 500lx，光照時間10h/d。

2 結果與分析

2.1 不同消毒劑對外植體褐變的影響 綠香椿頂芽在經過消毒處理后就出現部分芽莖顏色呈褐色，接種后3h即發現經H2O2處理的材料向培養基釋放褐色物質，10h后其他處理也出現褐變現象，其中AgNO3褐變最輕，12d后褐變基本穩定，結果（見表1）。10%H2O2處理的褐變率最高，達62.5%，且褐變最嚴重的。其次是2%NaClO，0.1%HgCl2和1%AgNO 3褐變率均較低。H2O2之所以嚴重，可能與其氧離子的氧化性有關，加速褐變的發生，具體原因還有待于進一步研究。從發芽率看，0.1%處HgCl2理的材料芽萌發率最高，達42.5%。其次是1%AgNO 3的37.5%，萌發率最低的是10%H2O2的17.5，由于褐變嚴重，導致了材料的死亡，造成萌發率低。因此，從芽萌發率考慮，選擇0.1%HgCl2處理10min效果更好。

2.2 不同添加物綠香椿外植體褐變的影響 本試驗在芽誘導培養基中分別添加具有抗褐化效果的活性炭、抗壞血酸和聚乙烯吡咯烷酮，3周后統計褐變率，4周后統計萌芽率（見表2）。試驗結果表明，3種添加物與對照（CK）相比有明顯的抗褐化效果，效果最好的是聚乙烯吡咯烷酮和抗壞血酸，褐化率只有15.0%，其次是活性炭20.0%。3種添加劑作用機理不同，活性炭是一種強吸附劑，對吸附對象沒有選擇性，酚類物質以及褐化產生的醌類物質都能被吸附；聚乙烯吡咯烷酮是酚類物質的專一吸附劑，常作為酚類物質和細胞的保護劑，對褐變有一定的防止作用，但受到酚類物質種類的影響[6]；抗壞血酸一方面使多酚氧化酶失活阻止酚類物質氧化，另一方面消耗掉溶解氧，使酚類物質因缺氧而無法氧化，對已形成的醌類物質則沒辦法破壞[7]。然而活性炭的強吸附作用降低了生長調節劑的作用效果，影響了外植體的發育，使萌芽率反而低于CK，而聚乙烯吡咯烷酮與抗壞血酸的褐變率相同，但萌芽率更高，可能前者對香椿芽萌發有促進作用。

3 討論與結論

褐變主要是酚類化合物在多酚氧化酶的催化下，被氧化成褐色的醌類化合物，醌類化合物在酪氨酸酶的作用下與植物組織中的蛋白質發生聚合，造成酶系統失活，導致代謝停止，生長受阻，最終使材料死亡[8]。由于褐變受酚類物質含量的影響，含量高的易發生褐變，植物體中酚類物質的含量又受到植物基因型、植株生長環境光照強弱等因素的影響。

褐變在植物組織培養初代培養中經常發生，香椿褐變現象研究的人很少，馬勤[9]在對香椿腋芽、許麗瓊等[10]對香椿葉片葉柄組培快繁中都遇到了褐變的問題，馬勤認為取材之前先弱光培養一段時間可減輕褐變，出現褐化后可連續轉接到新培養基中，減輕毒害，許麗瓊認為減輕褐變的方法是選則枝條中部的葉片和葉柄。本試驗采用頂芽為外植體進行研究，試驗結果表明，消毒劑的類型會影響到外植體的褐變程度，選擇具有氧化性的H2O2和NaClO褐變較嚴重，而非氧化性的AgNO3和HgCl2褐變較輕，且芽萌發率也高。在培養基中分別添加活性炭（AC）、抗壞血酸（VC）和聚乙烯吡咯烷酮（PVP），試驗結果表明3種添加劑對褐變都有明顯的減輕作用，其中1g/L的聚乙烯吡咯烷酮不僅能有效地防止褐變的發生，同時還能得到較高的芽萌發率。

參考文獻

[1]許墓農，陳香玲，李德生，等.優良品種香椿芽營養成分的研究[J].山東農業大學學報，1995，26（2）：137-143.

[2]孫鴻有，豐炳財，董飛岳，等.香椿芽萌發有效積溫與大棚栽培技術[J].浙江林學院學報，1998，1（1）：6-12.

[3]王文康.溫室香椿芽無土栽培技術[J].吉林蔬菜，2014（5）：19.

[4]王港，楊秀平，李周岐.活性炭對組織培養中植物激素的吸附作用[J].林業科技開發，2006，20（6）：26-27.

[5]田永亮，張文，張國珍，等.兩種抗生素對葡萄組培中污染菌的抑制作用[J].北方園藝，2005（5）：84-85.

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[8]陳世昌.植物組織培養[M].重慶：高等教育出版社，2011，87-94.

[9]馬勤.香椿T4品系組培快繁技術研究[D].楊凌：西北農林科技大學，2006，38-41.

[10]許麗瓊，涂炳坤.香椿葉片組織培養和快繁技術的研究[J].湖北農業科學，2007，46（1）：24-26. （責編：徐煥斗）