外源NO對(duì)干旱脅迫下板藍(lán)根種子萌發(fā)和幼苗生理特性的影響

摘要：為探索外源NO對(duì)干旱脅迫下板藍(lán)根種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響，用10%聚乙二醇（PEG） 6 000模擬干旱脅迫，測(cè)定不同濃度的外源NO供體硝普鈉（SNP）處理后板藍(lán)根種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)的變化。結(jié)果表明，干旱脅迫顯著抑制板藍(lán)根的種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)。0.01～0.50 mmol/L SNP處理后，種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)均有升高，其中以0.10 mmol/L SNP處理時(shí)各項(xiàng)指標(biāo)最高；1.00 mmol/L SNP處理的各項(xiàng)指標(biāo)無顯著變化或顯著降低。與干旱處理相比，0.10 mmol/L SNP處理時(shí)板藍(lán)根種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)分別提高22.94%和80.00%，發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)分別提高31.81%和82.03%，發(fā)芽速率指數(shù)提高31.77%，平均發(fā)芽時(shí)間縮短0.26 d；幼苗苗高、主根長(zhǎng)、苗質(zhì)量和根質(zhì)量分別提高39.27%、30.97%、58.06%和91.86%；葉片MDA含量降低32.37%，SOD和POD活性分別增加44.36%和44.02%。0.10 mmol/L SNP可顯著減緩干旱脅迫對(duì)板藍(lán)根種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的抑制作用，增強(qiáng)葉片抗氧化能力，提高種子及幼苗的抗旱能力；高濃度（1.00 mmol/L）SNP處理加劇了干旱脅迫對(duì)板藍(lán)根幼苗的傷害。

關(guān)鍵詞：板藍(lán)根；NO；干旱脅迫；種子萌發(fā)；生理特性

中圖分類號(hào)：S567.23+9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）07-1636-05

板藍(lán)根為十字花科菘藍(lán)（Isatis indigotica Fort.）的干燥根，為二年生草本植物，具有清熱解毒和涼血利咽的作用[1]。由于板藍(lán)根藥用價(jià)值非常大，在中醫(yī)藥中使用量也很大，是目前已實(shí)現(xiàn)規(guī)模化栽培和生產(chǎn)的重要中藥材[2]。尤其是2003年“非典”、2009年甲型流感、2013年禽流感大范圍流行，板藍(lán)根需求量更是劇增[3]。干早脅迫常常影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，由水分虧缺對(duì)農(nóng)作物造成的損失在所有的非生物脅迫中占首位[4]。在中國板藍(lán)根產(chǎn)區(qū)，水資源緊缺已成為影響板藍(lán)根高產(chǎn)的主要限制性因素之一[5]，板藍(lán)根栽培環(huán)境受到嚴(yán)重威脅，提高板藍(lán)根的抗旱能力已成為亟待解決的問題。

NO是生物體中一種重要的氧化還原信號(hào)分子和毒性分子，也是一種活性氮，在植物體內(nèi)主要通過NO合酶和硝酸還原酶催化形成。NO作為植物生長(zhǎng)發(fā)育的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，能夠?qū)χ参锏纳锖头巧锬婢匙鞒龇磻?yīng)，對(duì)植物具有保護(hù)和毒害的雙重效應(yīng)，具體表現(xiàn)與NO濃度和植物細(xì)胞的生理?xiàng)l件等有關(guān)[6]。種子萌發(fā)是植物生命歷程的起點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)外源NO對(duì)干旱脅迫下水稻[7]、黃瓜[8]、苜蓿[9]、高羊茅[10]和白花蛇舌草[11]種子萌發(fā)具有促進(jìn)作用，也可以提高小麥[12]、黃瓜[8]、高羊茅[10]幼苗葉片的抗氧化酶活性，緩解干旱脅迫對(duì)幼苗氧化損傷的影響。關(guān)于外源NO對(duì)干旱脅迫下板藍(lán)根種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響鮮有報(bào)道。本研究以板藍(lán)根種子為材料，通過聚乙二醇（PEG）6 000模擬干旱環(huán)境，研究不同濃度的外源NO供體硝普鈉（SNP）對(duì)干旱脅迫下板藍(lán)根種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)的影響，為解決板藍(lán)根在栽培生產(chǎn)中遇到的干旱問題提供理論依據(jù)，對(duì)板藍(lán)根的大面積推廣及規(guī)范種植具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的板藍(lán)根種子由山東省長(zhǎng)清馬山中藥材特色品牌基地提供，經(jīng)山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院王漢平教授鑒定為北板藍(lán)根的干燥成熟種子。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取健壯、飽滿、大小一致的板藍(lán)根種子，先后用75%乙醇和5% NaClO分別消毒5 min，去離子水沖洗5～6次，直至無NaClO味道。20 ℃下去離子水浸種12 h，將板藍(lán)根種子用無菌濾紙瀝干水，備用。試驗(yàn)采用10% PEG 6 000模擬干旱脅迫，在Hoagland營養(yǎng)液基礎(chǔ)上進(jìn)行如下處理：CK1（0%PEG 6 000+0 mmol/L SNP）、CK2（10% PEG 6 000+0 mmol/L SNP）、T1（10%PEG 6 000+0.01 mmol/L SNP）、T2（10%PEG6 000+0.10 mmol/L SNP）、T3（10%PEG 6 000+0.50 mmol/L SNP）、T4（10%PEG 6 000+1.00 mmol/L SNP）。

1.3 發(fā)芽試驗(yàn)

按照賈海鳳等[3]的方法進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)。每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50粒種子。在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行15 ℃/25 ℃的變溫培養(yǎng)，高溫時(shí)段采用8 h光照，低溫時(shí)段采用16 h黑暗。每隔3～5 d更換1次處理液。

1.4 種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)和生理指標(biāo)

突破種皮的胚軸長(zhǎng)度達(dá)到種子自身長(zhǎng)度時(shí)視為種子發(fā)芽。每天統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽數(shù)，計(jì)算種子萌發(fā)指標(biāo)，包括發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、發(fā)芽速率指數(shù)和平均發(fā)芽時(shí)間[3]。第14天時(shí)，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取20株幼苗，測(cè)量苗高、主根長(zhǎng)、苗質(zhì)量和根質(zhì)量（鮮重），取平均值，并測(cè)定生理指標(biāo)。采用硫代巴比妥酸法測(cè)定丙二醛（MDA）含量，采用氮藍(lán)四唑法測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）活性，采用愈創(chuàng)木酚比色法測(cè)定過氧化物酶（POD）活性。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2003軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和繪圖，采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度的SNP對(duì)干旱脅迫下板藍(lán)根種子萌發(fā)的影響

2.1.1 對(duì)發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)的影響 由圖1可以看出，與CK1相比，CK2處理的板藍(lán)根種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)均顯著降低，分別比CK1降低17.74%和41.18%，說明干旱處理顯著抑制了板藍(lán)根種子的萌發(fā)。當(dāng)用不同濃度的SNP處理后，處理T1、T2、T3的發(fā)芽率分別比CK2上升16.51%、22.94%和13.76%，發(fā)芽勢(shì)分別比CK2上升33.33%、80.00%和68.33%；T4處理的發(fā)芽率變化不顯著，發(fā)芽勢(shì)比CK2顯著降低，降低達(dá)20.00%。可見，T2處理時(shí)板藍(lán)根種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)最高，即0.10 mmol/L SNP最能有效緩解干旱脅迫對(duì)種子萌發(fā)的抑制作用，而高濃度（1.00 mmol/L）SNP則加重干旱脅迫對(duì)發(fā)芽勢(shì)的抑制作用。

2.1.2 對(duì)發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的影響 由圖2可以看出，與CK1相比，CK2處理的板藍(lán)根種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)分別降低13.78%和40.22%，說明干旱處理顯著抑制板藍(lán)根種子的活力。隨著SNP濃度的升高，板藍(lán)根種子的發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)呈先升高后降低的趨勢(shì)，0.10 mmol/L SNP處理時(shí)達(dá)到峰值。與CK2相比，T1、T2、T3處理的發(fā)芽指數(shù)分別增加19.16%、31.81%和22.23%，活力指數(shù)分別增加55.15%、82.03%和13.09%；T4處理的發(fā)芽指數(shù)變化不顯著，活力指數(shù)顯著降低，降低達(dá)19.78%。因此，適宜濃度的SNP能減輕干旱脅迫對(duì)發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的抑制作用，以0.10 mmol/L濃度時(shí)效果最佳，高濃度（1.00 mmol/L）SNP能加重干旱脅迫對(duì)活力指數(shù)的抑制作用。

2.1.3 對(duì)發(fā)芽速率指數(shù)和平均發(fā)芽時(shí)間的影響 由圖3可以看出，干旱脅迫下，CK2與CK1相比，板藍(lán)根種子的發(fā)芽速率指數(shù)顯著降低，平均發(fā)芽時(shí)間顯著延長(zhǎng)。隨著SNP濃度的升高，發(fā)芽速率指數(shù)呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，0.10 mmol/L SNP處理時(shí)達(dá)到最大值，為0.28；平均發(fā)芽時(shí)間呈先縮短后延長(zhǎng)的變化趨勢(shì)，0.10和0.50 mmol/L SNP處理時(shí)達(dá)到較小值，為3.19 d。

2.2 不同濃度SNP對(duì)干旱脅迫下板藍(lán)根幼苗生長(zhǎng)的影響

2.2.1 對(duì)苗高和主根長(zhǎng)的影響 由圖4可以看出，與CK1相比，CK2處理的苗高、主根長(zhǎng)分別降低了38.12%和50.82%，說明干旱處理顯著抑制了板藍(lán)根幼苗苗高和主根的生長(zhǎng)。不同濃度的SNP處理后，與CK2相比，處理T1、T2、T3的苗高分別增加14.79%、39.27%和16.90%，處理T4減少15.61%；處理T1和T3的主根長(zhǎng)度變化不顯著，T2處理顯著增加，增加達(dá)30.97%，處理T4顯著降低，降低達(dá)25.83%。說明，0.10 mmol/L SNP能有效減輕干旱脅迫對(duì)板藍(lán)根幼苗生長(zhǎng)的傷害，高濃度（1.00 mmol/L）的SNP處理則加劇了干旱脅迫的傷害。

2.2.2 對(duì)苗質(zhì)量和根質(zhì)量的影響 由圖5可以看出，CK2處理下，苗質(zhì)量和根質(zhì)量分別比CK1降低了44.64%和66.01%。隨著SNP濃度的升高，苗質(zhì)量和根質(zhì)量均呈單峰曲線變化，0.10 mmol/L SNP處理時(shí)表現(xiàn)最高，分別為0.16 g/株和0.02 g/株；1.00 mmol/L處理時(shí)表現(xiàn)最低，分別為0.09 g/株和0.01 g/株。表明干旱脅迫顯著抑制了板藍(lán)根幼苗的物質(zhì)積累，0.10 mmol/L SNP能有效減輕干旱脅迫的抑制作用，高濃度SNP（1.00 mmol/L）則加劇了干旱脅迫的抑制作用。

2.3 不同濃度的SNP對(duì)干旱脅迫下板藍(lán)根幼苗生理特性的影響

2.3.1 MDA含量 由圖6可以看出，干旱處理后，CK2與CK1相比，板藍(lán)根幼苗葉片MDA含量顯著升高。與CK2相比，不同濃度SNP處理的MDA含量均顯著降低，且隨SNP濃度的升高呈先降低后升高的變化趨勢(shì)，在0.10 mmol/L SNP處理時(shí)表現(xiàn)為最低。說明SNP能夠抑制干旱脅迫下MDA含量的升高，且0.10 mmol/L SNP的抑制效果最好。

2.3.2 SOD和POD活性 由圖7可以看出，與CK1相比，CK2的板藍(lán)根幼苗葉片SOD和POD活性顯著升高，分別升高38.89%和13.06%。與CK2相比，隨著SNP處理濃度的增加，SOD和POD活性呈單峰曲線變化，且在0.10 mmol/L SNP處理時(shí)達(dá)到峰值。說明板藍(lán)根幼苗對(duì)干旱脅迫具有一定的適應(yīng)調(diào)節(jié)能力，適宜濃度的SNP能緩解干旱脅迫對(duì)板藍(lán)根幼苗產(chǎn)生的活性氧傷害。

3 小結(jié)與討論

3.1 外源NO對(duì)干旱脅迫下板藍(lán)根種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響

聚乙二醇（PEG）是一種高分子滲透劑，其本身不能穿越細(xì)胞壁進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，因而不會(huì)引起質(zhì)壁分離，使植物組織和細(xì)胞處于類似于干旱的水分脅迫之中。宋軍生等[13]的研究表明，PEG脅迫下板藍(lán)根種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和胚芽鮮重均顯著下降。本研究中，在PEG模擬干旱脅迫下，板藍(lán)根種子的萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)降低，這與前人的研究結(jié)果一致；干旱脅迫下，添加適宜濃度的外源NO緩解了干旱脅迫對(duì)板藍(lán)根種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的抑制作用，高濃度的SNP則加劇了干旱脅迫的抑制作用。這可能是因?yàn)镹O通過質(zhì)外體直接作用于細(xì)胞壁組分，使細(xì)胞壁松弛，以及NO作用于膜的磷脂雙分子層，增強(qiáng)膜的流動(dòng)性，從而促進(jìn)細(xì)胞擴(kuò)展、植物生長(zhǎng)[14]；NO濃度過高時(shí)，NO與超氧陰離子和過氧亞硝酸鹽作用導(dǎo)致膜滲漏，甚至擴(kuò)散進(jìn)入胞質(zhì)溶膠，攻擊相關(guān)的酶類，產(chǎn)生破壞性影響[15]。

除了調(diào)控根系伸長(zhǎng)和生長(zhǎng)，NO還參與側(cè)根、不定根和根毛的發(fā)生[16]，且能增加根系中果膠、纖維素、半纖維素等物質(zhì)的含量[17]。試驗(yàn)中，0.10 mmol/L SNP對(duì)苗高的促進(jìn)作用大于根長(zhǎng)，而對(duì)苗質(zhì)量的促進(jìn)作用小于根質(zhì)量。究其原因，SNP可能影響了板藍(lán)根幼苗的根系結(jié)構(gòu)或成分，這還有待進(jìn)一步確定。

3.2 外源NO對(duì)干旱脅迫下板藍(lán)根幼苗生理特性的影響

植物受到逆境脅迫時(shí)，體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），而超氧陰離子是活性氧中最豐富的一種，活性氧若不能及時(shí)被清除，會(huì)導(dǎo)致氧化傷害[18]。MDA是膜脂過氧化產(chǎn)物，通常用來表示細(xì)胞膜脂過氧化程度和植物對(duì)逆境條件反應(yīng)的強(qiáng)弱。SOD可以將超氧陰離子歧化為H2O2，而POD可以清除植物體內(nèi)的多余的H2O2。本研究中，干旱脅迫下板藍(lán)根幼苗葉片MDA含量升高，說明干旱脅迫對(duì)板藍(lán)根幼苗造成了傷害，加速了板藍(lán)根幼苗細(xì)胞的膜脂過氧化作用，這與宋軍生等[13]的研究結(jié)果一致。干旱脅迫下幼苗葉片SOD和POD活性升高，這是植物自身的一種應(yīng)激反應(yīng)。

NO具有信號(hào)分子的作用，可作為抗氧化劑直接清除逆境脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS，或激活一系列逆境抗性基因的表達(dá)和調(diào)控，以緩解各種脅迫造成的氧化損傷，從而增強(qiáng)植物的適應(yīng)能力[19]。本研究中，0.10 mmol/L SNP處理時(shí)，板藍(lán)根幼苗葉片MDA含量最低，SOD和POD活性最高。因此，適宜濃度的外源NO能有效緩解干旱脅迫下板藍(lán)根幼苗葉片的膜脂過氧化作用，誘導(dǎo)抗氧化酶活性升高，提高清除自由基防御系統(tǒng)的防御能力，緩解干旱脅迫對(duì)板藍(lán)根幼苗生長(zhǎng)的抑制作用。關(guān)于外源NO對(duì)干旱脅迫下板藍(lán)根幼苗ROS代謝的調(diào)控過程、機(jī)制及有關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，還有待進(jìn)一步研究。

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