響應面法對漆斑菌液體發酵產膽紅素氧化酶條件的優化

摘要：對漆斑菌（Myrothecium sp. IMER1）菌株液體發酵產膽紅素氧化酶的條件進行了優化。采用單因素試驗篩選出最適碳源為葡萄糖，氮源為硝酸銨，pH為7，溫度為28 ℃和最有效促進產酶的金屬離子為Cu2+。在此基礎上，利用Plackett-Burman 設計對影響產酶因素的效應進行評價，篩選出具有顯著影響的3個因素葡萄糖、pH和溫度。用最陡爬坡路徑逼近最大產酶區域后，利用響應面中心組合設計對顯著因素進行優化，得出pH、溫度和葡萄糖分別為5.7、28 ℃、8 g/L時，優化后液體發酵液中膽紅素氧化酶活力提高到0.627 U/mL，比未優化前的酶活力0.214 U/mL提高了近2倍，結果表明單因素與響應面結合法可優化菌株IMER1液體發酵產膽紅素氧化酶的條件。

關鍵詞：膽紅素氧化酶；漆斑菌（Myrothecium sp. IMER1）；Plackett-Burman設計；響應面法

中圖分類號：Q556 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）05-1150-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.05.031

Abstract：The fermentation conditions of producing bilirubin oxidase （BOX） by Myrothecium sp. IMER1 were optimized. The optimal carbon source glucose， nitrogen source NH4NO3， pH 7， 28 ℃ and metal ion Cu2+ were screened with single factorial experiments. Plackett-Burman design was used to evaluate the effects of six factors related to BOX production. Three statistically significant factors including glucose， pH and temperature were selected. The path of steepest ascent was used to approach the optimal region of BOX production subsequently. The optimal combined concentration for maximum enzyme activity was further optimized by response surface methodology and determined as follows： 5.7，28 ℃， 8 g/L. The maximum enzyme activity was 0.627 U/mL. The optimization of culture conditions of IMER1 led to about 2 fold increase in BOX enzyme activity compared with initial result 0.214 U/mL， indicating that single factor in combination with response surface methodology was an effective method for optimizing BOX enzyme activity conditions by Myrothecium sp. IMER1.

Key words： bilirubin oxidase； Myrothecium sp. IMER1； Plackett-Burman design； response surface methodology

漆斑菌屬（Myrothecium）是一種無性型絲狀真菌，屬于半知菌亞門絲孢綱絲孢目瘤座孢科（Tuberculariaceae）。漆斑菌屬是產膽紅素氧化酶的主要真菌，工業上常用該屬菌株生產膽紅素氧化酶（Bilirubin oxidase， BOX）[1]。膽紅素氧化酶是一種含銅的多酚氧化酶， 能催化膽紅素氧化， 氧氣是其電子受體。反應過程為膽紅素氧化酶催化膽紅素生成膽綠素， 后者可進一步氧化最終生成無色化合物[2-4]。在臨床檢驗中，常使用膽紅素氧化酶來測定血液中膽紅素的含量。相比較其他膽紅素測定方法，酶學方法具有特異性、靈敏度高和操作簡便等優點，適用于臨床手工或自動化檢測[5，6]。近年來，由于膽紅素氧化酶的底物范圍廣和氧化能力強， 目前已被用于生物電池的制造、 污水處理等方面的研究[7-11]。

響應面法是利用合理的試驗設計并通過試驗得到的一定數據，采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應值之間的函數關系，通過對回歸方程的分析來尋求最優工藝參數，解決多變量問題的一種統計方法。該方法在優化研究中應用頻繁，是降低開發成本、優化加工條件、提高產品質量、解決生產過程中實際問題的一種有效方法，已廣泛地應用于農業、生物、食品、化學、制造等領域[12]。為了提高漆斑菌產BOX的能力，使其產酶量達到工業生產規模的需求，本試驗對漆斑菌菌株Myrothecium sp.IMER1在液體培養體系中發酵產酶的影響因子進行了研究和優化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試漆斑菌IMER1，從武漢植物園土壤中分離得到；2，2-連氮-雙（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸銨）（ABTS），美國SIGMA公司；馬鈴薯液體培養基（PDB）：20%馬鈴薯（削片煮水）+2%葡萄糖。

紫外可見分光光度儀（UNICO-UV-2000型），上海尤尼柯儀器有限公司；臺式高速冷凍離心機（TGL-16/TGL16型），湖南湘儀集團；全溫氣浴振蕩搖床（ZD-88型），金壇市成輝儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 液體培養 IMER1菌株斜面培養于PDA培養基中，26～27 ℃靜置，通常5～7 d可產生大量的分生孢子，用適量的蒸餾水將試管中的孢子沖洗出來，通過顯微計數，將孢子數量調整到1×108 個/mL，使用前將孢子懸浮液搖勻。用移液槍吸取不同量孢子液注射入滅菌后的培養基中。將接種的培養基放在搖床中，150 r/min下振蕩培養，根據需要調整培養液的起始pH和培養溫度。菌株IMER1在液體基質中培養一段時間后， 將菌絲過濾即得到粗酶液。

1.2.2 酶活測定 酶活測定采用ABTS法，參考文獻[13]。在3 mL反應體系中，含有2.7 mL pH 4.5的0.2 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液、0.1 mL酶液、0.2 mL 1 mmol/L ABTS，按次序混合并搖勻，30 s后開始記錄A420 nm，每隔15 s記錄一個A420 nm值。一個酶活力單位（U）：在上述條件下，每分鐘催化1 μmol ABTS氧化所需的酶量。

1.2.3 單因素試驗 篩選漆斑菌IMER1培養的最適碳源、氮源、pH、溫度和金屬離子。①碳源。采用不同碳源木糖、甘露糖、蔗糖、葡萄糖、微晶纖維素添加到培養基中，測定菌株IMER1產BOX的相對酶活；②氮源。采用有機氮源（蛋白胨、尿素、酵母浸膏）和無機氮源（硝酸銨、硫酸銨）添加到培養基中，測定菌株IMER1產BOX的相對酶活；③pH。調節培養基使其處于不同的pH（4、5、6、7、8、9、10、11），測定菌株IMER1產BOX的相對酶活；④溫度。在不同的溫度下培養（22、28、32、37 ℃）， 測定菌株IMER1產BOX的相對酶活；⑤金屬離子。在培養基中添加不同金屬離子（Na+、K+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、 Fe3+、 Co2+）， 測定菌株IMER1產BOX的相對酶活。

1.3 響應面設計和統計分析

采用SAS？誖8.0軟件中的試驗設計程序進行響應面分析，并利用該軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 不同碳源和氮源的影響 如圖1所示，在對照培養基中，菌株IMER1生長良好，但產酶量不大；在加入蔗糖和葡萄糖的培養基中，BOX產量是對照的2.5倍；在加入微晶纖維素的培養基中，菌株IMER1生長慢，但BOX產量是對照的2倍左右；在加入木糖和甘露糖的培養基中，菌株IMER1生長速度一般，BOX產量比較低。結果表明，在對照培養基中，由于缺乏速效碳源，從而影響了BOX的產量；葡萄糖作為速效碳源可明顯提高BOX產量，蔗糖也有類似的效果，可能是因為蔗糖水解后也可產生葡萄糖；而木糖和甘露糖對菌株生長和BOX的分泌具有一定的抑制作用；微晶纖維素雖然不能促進菌株IMER1的生長，但可以促進其產酶。

如圖2所示，和對照相比，在不同氮源中硝酸銨對菌株IMER1產BOX酶有明顯的促進作用，而尿素對產酶有抑制作用。有機氮源（蛋白胨、尿素、酵母浸膏）和無機氮源（硝酸銨、硫酸銨）相比，無機氮源作為一種速效氮源對產酶的影響較大。

2.1.2 不同pH的影響 如圖3所示，培養基pH 為7是該菌產酶的最適pH，在中性偏堿性的環境（pH 7～9）中，BOX產量要比在酸性環境高，且在pH 4、5時菌株IMER1生長較差，而在堿性環境下，生長較好。表明菌株IMER1作為一種耐堿性真菌，在中性偏堿性的pH范圍內能較好地分泌BOX。

2.1.3 不同溫度的影響 如圖4所示，28 ℃時菌株IMER1的生長速度快，BOX產量最大，而在較低溫度22 ℃時，該菌株生長較慢，酶產量也較低；在37 ℃時，菌株IMER1的孢子未能萌發，所以在其發酵液中未測到BOX酶活。結果表明，最適的產酶溫度為28 ℃，高溫會抑制孢子的萌發。

2.1.4 不同金屬離子的影響 如圖5所示，Fe3+和Mn2+對菌株IMER1產BOX有一定的抑制作用，K+、Zn2+、Mg2+對產酶的影響較小，Na+、Co2+離子對產BOX有一定的促進作用，而Cu2+對其產酶的促進作用最強。

2.2 響應面法優化液體培養體系產酶條件

2.2.1 主效因素的確定 Plackett-Burman （PB）法是一種近飽和的2水平試驗設計方法，它基于非完全平衡塊原理，能用最少的試驗次數估計出因素的主效應，從眾多的考察因素中快速有效地篩選出最為重要的幾個因素供進一步研究。根據上述單因素試驗結果，影響菌株IMER1液體發酵產酶的可能因素包括溫度、pH、氮源、碳源（葡萄糖，Glu）、銅離子等。選用N=8的Plackett-Burman設計，并設3個空白作為誤差分析項，結果見表1，各因素所代表的參數及因素效應評價見表2。由表2可知，對菌株IMER1液體發酵產酶有顯著影響的因素有碳源、pH和溫度。溫度對產酶呈正效應，碳源和pH則呈較大的負效應。要提高產酶量，應適當提高溫度，降低葡萄糖的濃度。

2.2.2 最陡爬坡試驗確定響應面試驗因素水平的中心點 根據Plackett-Burman法篩選出的顯著因素效應大小設定它們的步長，進行最陡爬坡試驗設計，尋找最大產酶區。根據Glu、pH和溫度3個因素效應大小的比例設定它們的變化方向及步長，最陡爬坡試驗設計及試驗測得結果如表3所示，最大產酶區在第3次試驗附近，故以試驗3的條件為響應面試驗因素水平的中心點。根據Plackett-Burman試驗和最陡爬坡試驗確定的試驗因素與水平詳見表4。

2.2.3 響應面設計確定顯著因素的最優水平 利用最大產酶區對應的條件進行響應面中心組合試驗設計，以試驗結果擬合建立描述響應量（BOX酶活）與自變量（影響產酶的顯著因素）關系的多項式回歸模型，運用SAS軟件對試驗數據進行回歸擬合，并對擬合方程作顯著性檢驗及方差分析。三因素五水平的響應面中心組合試驗設計及試驗測得的酶活力結果見表5。

1）回歸模型的建立及置信度分析。以BOX酶活為響應值，根據表5的試驗結果，用SAS統計分析軟件進行多元回歸分析，所得的主要分析結果見表6、表7。從方差分析中可以看出，各試驗因素響應值的影響不是簡單的線性關系。根據試驗因素對響應值的影響，擬合得到多項式回歸模型為：Y1=0.642 963+0.014 722×pH+0.004 44×Glu-0.153 056×T-0.099 537×pH×pH+0.058 889×pH×Glu-0.005×pH×T-0.067 87×Glu×Glu+0.098 889×Glu×T-0.076 204×T×T。

從表6中可以看出，用上述回歸方程描述各因素與響應值之間的關系時，其因變量和自變量之間的線性關系是顯著的，決定系數為98.71%，說明回歸方程的擬合程度很好。

2）顯著因素水平的優化和驗證。運用SAS軟件對回歸模型進行規范性分析，尋求最大酶活量的穩定點及對應的因素水平，結合圖6的回歸方程的三維響應面圖和等高線圖可知，回歸模型存在穩定點，對應的pH、T、Glu實際取值分別為5.7、28 ℃、8 g/L，BOX酶活的最大估計值為0.643 U/mL。在以上優化條件下進行驗證試驗，共進行3次100 mL的搖瓶試驗，BOX酶活分別為0.582、0.639、0.662 U/mL，平均值為0.627 U/mL。證明預測值0.643 U/mL與試驗平均值0.627 U/mL非常接近，同時比沒有優化前的酶活力0.214 U/mL提高了近2倍。

3 小結

漆斑菌屬是產BOX的主要真菌，有關其產酶條件的優化報道不多。多數微生物產酶條件優化采用單因素試驗、正交試驗及響應面試驗分析，這些方法存在一定的缺陷[14]。本試驗通過整合單因素試驗和Plackett-Burman設計，結合最陡爬坡路徑試驗和響應面中心組合設計，對菌株Myrothecium sp.IMER1在液體培養體系中高效產膽紅素氧化酶條件進行了優化，獲得了比較理想的結果。菌株IMER1以PDB培養基為基礎，在外加碳源和氮源中，葡萄糖、蔗糖和硝酸銨能提高BOX產量；在中性偏堿性的pH 7～9范圍內，BOX產量要比在酸性條件下高，其最適產酶pH為7；最適產酶溫度為28 ℃；在培養基中加入Cu2+對產BOX有明顯的促進作用。運用響應面法優化液體體系產BOX酶的條件，結果表明，在pH、溫度、Cu2+、碳源和氮源等影響因素中，pH、溫度和碳源屬于主效因子。當pH、溫度和葡萄糖分別為5.7、28 ℃、8 g/L時，酶活力可達到最大優化值，比沒有優化前的酶活力量提高近2倍。

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