褐飛虱呼腸孤病毒干擾水稻鋸齒葉矮縮病毒的初步研究

摘要：褐飛虱（Nilaparvata lugens Stal）可攜帶多種病毒，其中褐飛虱呼腸孤病毒（Nilaparvata lugens reovirus， NLRV）和水稻鋸齒葉矮縮病毒（Rice ragged stunt virus，RRSV）均為dsRNA基因組的呼腸孤病毒。通過接種、dsRNA小量提取及RT-PCR等方法分析NLRV對RRSV傳播和增殖的影響，初步探討這兩種呼腸孤病毒之間的關系。結果表明，褐飛虱攜帶NLRV比率高低影響褐飛虱接種RRSV效率；攜帶NLRV的褐飛虱種群接種RRSV后兩種病毒的含量差異較大，NLRV的含量遠遠大于RRSV的含量，推測褐飛虱體內的NLRV某種程度上干擾了RRSV的傳播和增殖。

關鍵詞：dsRNA病毒；褐飛虱呼腸孤病毒；水稻鋸齒葉矮縮病毒

中圖分類號：S432.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）05-1090-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.05.015

Abstact：Many viruses have been found in brown planthopper， in which Nilaparvata lugens reovirus（NLRV） and Rice ragged stunt virus（RRSV） are two reoviruses with dsRNA genomes. The relationship between NLRV and RRSV was primarily studied. By biological inoculation tests， small dsRNA rapid extraction method and RT-PCR， the effects of NLRV and RRSV on transmission and proliferation were studied. The presence of NLRV in brown planthopper affected the inoculation efficiency of RRSV. The viruliferous brown planthoppers with NLRV were inoculated with RRSV and then the circulative period passed， the concentrations of two reoviruses in vectors were different. NLRV was more higher than RRSV. It is indicated that NLRV could interfere the transmission and proliferation of RRSV in brown planthopper to some extent.

Key words： dsRNA virus； Nilaparvata lugens reovirus； Rice ragged stunt virus

病毒學研究往往多集中在單一病毒的諸多特性方面，對寄主或介體體內病毒與病毒之間，病毒與其它生物之間的復合感染以及復合感染所引起的生物學現象關注較少[1，2]。越來越多的證據顯示病毒的復合感染是一種極其普遍的現象[3]。病毒的復合感染可以減輕或加重某種病害的發生，這主要取決于病毒之間的協同或拮抗或競爭等關系[4-7]，根據這種關系可以解釋病害加重或減輕發生的原因，從而采取相應措施控制病害的發生[8]。褐飛虱（Nilaparvata lugens Stal）也可以攜帶多種病毒，其中褐飛虱呼腸孤病毒（Nilaparvata lugens reovirus，NLRV）和水稻鋸齒葉矮縮病毒（Rice ragged stunt virus，RRSV）均為dsRNA基因組的呼腸孤病毒[9]。NLRV是斐濟病毒屬（Fijivirus）成員，可以經卵傳播給后代，同時還可以通過水稻傳染給不帶毒的褐飛虱，但病毒在水稻內不復制[10-12]；RRSV是水稻病毒屬（Oryzavirus）的成員，由褐飛虱持久性攜卵而引發水稻鋸齒葉矮縮病，并隨著褐飛虱的長距離遷飛而傳播擴散[13-18]，兩種病毒之間的關系未知。與褐飛虱一樣，白背飛虱也是南方稻區最重要的稻飛虱之一，危害水稻和傳播水稻病毒（南方水稻黑條矮縮病毒，Southern rice black streaked dwarf virus，SRBSDV）。但白背飛虱攜帶和傳播SRBSDV的效率極高[19，20]，這可能是SRBSDV易造成爆發和大面積流行的原因之一；而褐飛虱攜帶和傳播RRSV的效率都較低，因此推測可能是水稻鋸齒葉矮縮病一直僅限于局部地區流行的原因之一。導致褐飛虱攜帶和傳播RRSV效率都較低的原因及與NLRV等病毒的關系一直是研究者比較感興趣的問題。基于此，通過接種、dsRNA小量提取和RT-PCR等方法，初步研究NLRV對RRSV傳播和增殖的影響，為深入研究這兩種病毒間的關系奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

植物材料：水稻鋸齒葉矮縮病病株于2010年采集于福建省龍巖市發病田間，鑒定后隔離種植；接種水稻品種為水稻鋸齒葉矮縮病感病品種Ⅱ優航2號。

昆蟲介體：褐飛虱群體2010年采集于福建福州市郊區無水稻鋸齒葉矮縮病發生的田塊，并經過鑒定后于實驗室網箱中飼養。

1.2 生物學接種

1.2.1 褐飛虱飼毒 采用兩種飼毒RRSV的方法。第一種方法是抓取網箱中飼養的二齡若蟲于病株上飼毒，第二種方法是模擬自然條件下，抓取網箱中飼養的雌性褐飛虱成蟲在病株上產卵，卵孵化成若蟲后直接在病株上飼毒。飼毒后的介體度過循回期（29 ℃下循回期平均為7.6 d[21，22]）備用。

1.2.2 單管單苗接種 選擇飼毒后度過循回期的褐飛虱成蟲（每種方法40頭，重復3次）進行單蟲單管單苗生物學接種，接種水稻苗處于2葉1心期（下同），傳毒8 d，然后將傳毒成蟲低溫保存，接種苗每24 h換一次，接種苗按編號種植于防蟲溫室內。

1.3 快速小量提取dsRNA

介體昆蟲體內的dsRNA參照食用菌病毒dsRNA的提取[23]。方法如下：選用褐飛虱100～200頭，用液氮研磨成粉末；加入0.7 mL 2×STE和0.7 mL酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1）抽提處理，離心后取上清液，將上清液配制成含17%乙醇的溶液；注入含17%乙醇的1×STE溶液平衡過的纖維素（CF-11）中，充分混勻，離心后去上清，再用含17%乙醇的1×STE溶液反復洗滌3～4次；最后用不含乙醇的1×STE洗脫，洗脫液經過異丙醇沉淀和75%乙醇漂洗，沉淀即為dsRNA，干燥后溶于RNase-free的水中。dsRNA產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后BioRad凝膠成像系統觀察記錄。

1.4 RT-PCR法檢測褐飛虱介體帶毒率

取傳毒后低溫保存的成蟲各24頭，用RT-PCR法檢測褐飛虱攜帶兩種病毒的情況，RRSV和NLRV兩種病毒的dsRNA作為陽性對照。RRSV的檢測引物為P9F/P9R（P9F：5′-ATGAAGACTGCCTTTGCCA

GA-3′，P9R：5′-CTACCCCGAGG CCTTCTGAGA-3′），根據泰國分離物S9片段（NC_003757）設計，擴增片段大小為1 017 bp；NLRV的檢測引物為N8F/R（N8F：5′-AATCACTCATTGAACAAGGA TGGACG-3′，N8R：5′-CTACCAACCCAGTCGGTCCTTCAAATA-3′），根據已發表的NLRV S8的序列，擴增片段大小為560 bp[24]。單頭褐飛虱總RNA采用Trizol試劑盒（北京天根）提取，參照說明進行，最后用20 μL的無核酸酶滅菌水溶解。反轉錄按照反轉錄試劑盒（Fermentas）說明進行操作。PCR反應體系按照TaKaRa的rTaq酶使用說明進行，反應程序為：94 ℃變性4 min，35個循環的擴增（94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s），最后72 ℃延伸10 min，產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后BioRad凝膠成像系統觀察記錄。

2 結果與分析

2.1 生物學接種結果

兩種飼毒方法獲得的褐飛虱成蟲單管單苗生物學接種結果見表1。從表1中得出，能夠傳毒的褐飛虱成蟲分別占試驗成蟲總數的22.50%、50.00%；生物學接種320株水稻分別有24株、44株發病，發病率為7.50%、13.75%。

2.2 褐飛虱體內dsRNA的提取和檢測結果

收集接種RRSV和未接種RRSV的褐飛虱種群，提取并檢測褐飛虱種群體內的dsRNA情況，以協助了解介體體內的帶毒情況以及dsRNA病毒種類。經過反復試驗，從褐飛虱體內提取dsRNA以0.2～0.3 g為宜（100～200頭）。圖1是褐飛虱（100-200頭）體內的dsRNA，從其dsRNA基因圖譜中可清晰地看到褐飛虱體內存在NLRV，飼毒RRSV后體內的病毒除了NLRV外，還有RRSV，但兩種病毒的含量差別較大，NLRV含量遠大于RRSV。

2.3 褐飛虱介體帶毒率

由圖2可知，在方法1和方法2中，24頭成蟲中攜帶RRSV分別有13頭和18頭，帶毒率分別為54.17%、75.00%，帶毒率差異較大；而攜帶NLVR分別為23頭、24頭，帶毒率分別為95.83%、100.00%，帶毒率差異較小。

3 小結與討論

生物學接種試驗和褐飛虱帶毒率檢測結果表明，在方法1中，使用二齡若蟲飼毒RRSV，度過循回期后成蟲帶毒率為54.17%，帶毒且能夠傳毒的成蟲為42.85%，這些數據與以往報道的數據相符合[13，21，25，26]；在方法2中，模擬自然條件下在病株上產卵、飼毒和度過循回期后，帶毒率較高，成蟲帶毒率約為75%，帶毒且能夠傳毒的成蟲約為50%，這些數據皆比以往報道的數據高一些[13，21，25，26]。兩種方法不同點之處在于飼毒RRSV時褐飛虱攜帶NLRV的差異。NLRV可以經卵傳播，經卵傳播比率為15%[10，12]，在方法1中，卵孵化成若蟲后攜帶NLRV的比率低于15%，多數介體首先接種的是RRSV；而室內飼養的褐飛虱種群帶毒率一般都在90%以上[10，24]。在方法2中，二齡褐飛虱若蟲在飼毒RRSV之前多數都攜帶了NLRV。因此，根據生物學接種和褐飛虱帶毒率檢測結果初步推測NLRV能在一定程度上影響褐飛虱生物學接種RRSV以及褐飛虱的傳毒效率。此外，NLRV和RRSV都是褐飛虱體內增殖性病毒[12，15]，但兩者同時存在時，NLRV的含量遠遠大于RRSV（如圖2），這也說明NLRV可能某種程度上干擾了RRSV在體內的增殖。褐飛虱是一種典型的遷飛性害蟲，每年春季或夏季由南向北遷移、秋季由北向南回遷，在中國境內分布范圍幾乎覆蓋全境，褐飛虱一旦帶毒，則可以將水稻鋸齒葉矮縮病毒傳進遷入地區[13，14，16-18]。水稻鋸齒葉矮縮病首先發現于菲律賓和印度尼西亞，并于20世紀70年代末在日本、印度及東南亞一些國家局部地區引起水稻大面積減產[13-15]；在中國該病自1978年以來，先后在臺灣、福建、廣東和江西等省發生流行，對水稻生產造成了一定的影響[15，21，25]。但相對于白背飛虱傳播的水稻南方黑條矮縮病毒病等大面積流行病害來說，水稻鋸齒葉矮縮病一直僅限于局部地區流行，危害程度遠不及水稻南方黑條矮縮病毒病[20，27]，具體原因鮮見報道。本研究發現NLRV可能某種程度上干擾了RRSV在褐飛虱體內的增殖以及傳播，從病毒與病毒之間的拮抗方面初步分析了NLRV的存在可以減輕水稻鋸齒葉矮縮病的發生和流行，從某種程度上解釋了水稻鋸齒葉矮縮病一直僅限于局部地區流行的現象。

參考文獻：

[1] LIDSKY P V， ROMANOVA L I， KOLESNIKOWA M S， et al. Interactions between viral and prokaryotic pathogens in a mixed infection with cardiovirus and mycoplasma[J]. Journal of Virology， 2009， 83： 9940-9951.

[2] RENTER？魱A-CANETT I， XOCONOSTLE-C？魣ZARES B， RUIZ-MEDRANO R， et al. Geminivirus mixed infection on pepper plants： Synergistic interaction between PHYVV and PepGMV[J]. Virology， 2011， 8（1）：104.

[3] DAPALMA T， DOONAN B P， TRAGER N M， et al. A systematic approach to virus-virus interactions[J]. Virus Research， 2010， 149： 1-9.

[4] VANCE V B. Replication of potato virus X RNA is altered in coinfections with potato virus Y[J]. Virology，1991，182：486-494.

[5] GONZ？魣LEZ-JARA P， TENLLADO F， MART？魱NEZ-GARC？魱A B， et al. Host-dependent differences during synergistic infection by potyviruses with potato virus X[J]. Molecular Plant Pathology， 2004， 5： 29-35.

[6] FOLIMONOVA S Y， ROBERTSON， C J， SHILTS T， et al.Infection with strains of citrus tristeza virus does not exclude superinfection by other strains of the virus[J]. Journal of Virology， 2010， 84： 1314-1325.

[7] DIETRICH C， MAISS E. Fluorescent labelling reveals spatial separation of potyvirus populations in mixed infected Nicotiana benthamiana plants[J]. Journal of General Virology，2003， 84： 2871-2876.

[8] BALMER O， STEARNS S C， SCH？魻TZAU A， et al.Intraspecific competition between co-infecting parasite strains enhances host survival in African trypanosomes[J]. Ecology， 2009， 90： 3367-3378.

[9] 張寶琴，張傳溪.遷飛稻飛虱與病毒入侵[A].第三屆全國生物入侵大會論文摘要集-全球變化與生物入侵[C].海口：2010.

[10] NAKASHIMA N， NODA H. Nonpathogenic Naparvata lugens reovirus is transmitted to the brown planthopper through rice plant[J]. Virology， 1995， 207： 303-307.

[11] NAKASHIMA N， KOIZUMI M， WATANABE H， et al.Complete nucleotide sequence of the Nilaparvata lugens reovirus：a putative member of the genus Fijivirus[J]. Journal of General Virology， 1996， 77（1）： 139-146.

[12] NODA H， LSHIKAWA K， HIBINO H， et al. A reovirus in the brown planthopper，Nilaparvata lugens[J]. Journal of General virology， 1991， 72： 2425-2430.

[13] HIBINO H， ROECHAN M， SUDARISMAN S， et al. A virus disease of rice （\"kerdil hampa\"） transmitted by brown planthopper Nilaparvata lugens Stal in Indonesia[M]. Bogor： Central Research Institute for Agriculture （Indonesia）， 1977.

[14] LING K C， TIONCO E R， AGUIERO V M. Rice ragged stunt， a new virus disease[J]. Plant Dis Reptr， 1978， 62： 701-705.

[15] 鄭璐平，謝荔巖，連玲麗，等.水稻齒葉矮縮病毒的研究進展[J].中國農業科技導報，2008，10（5）：8-12.

[16] 巫國瑞，胡 萃.稻飛虱[M].北京：農業出版社，1987.

[17] HENOG K L， HARDY B. Planthoppers： New threats to the sustainability of Intensive Rice Production Systems in Asia[M]. Los Ba■os： International Rice Research Institute，2009.

[18] 翟保平，周國輝，陶小榮，等.稻飛虱爆發與水稻病毒病的宏觀規律和微觀機制[J].應用昆蟲學報，2011，48（3）：480-487.

[19]PU L L， XIE G H， JI C Y， et al. Transmission characteristics of Southern rice black-streaked dwarf virus by rice planthoppers[J]. Crop Protection， 2012， 41： 71-76.

[20] ZHOU G H， XU D L， XU D G， et al. Southern rice black-streaked dwarf virus： a white-backed planthopper-transmitted fijivirus threatening rice production in Asia[J].. Frontiers in Microbiology， 2013， 4： 270.

[21] XIE L H， LIN Q Y. Rice ragged stunt virus disease， a new record of rice virus disease in China[J]. Chinese Science Bulletin， 1980， 25： 961-968.

[22] 方中達，陸家云，葉鐘音.中國農業百科全書植物病理學卷[M].北京：中國農業出版社，1996.

[23] 郭靈芳，張長青，魯紅學，等.一種簡單快速的食用菌病毒dsRNA提取方法[J].實驗技術與管理，2010，27（12）：52-57.

[24] 劉小娟.NLRV五個分離物序列測定及病毒在褐飛虱體內定位研究[D].福州：福建農林大學，2012.

[25] ZHOU L K，LING K C. Rice ragged stunt disease in China[J]. IRRN，1979，4（6）：10.

[26] 沈菊英，彭寶珍，龔祖塤.水稻齒葉矮縮病毒在水稻病葉及傳毒媒介昆蟲組織內的形態[J].上海農業學報，1989，5（2）：15-18.

[27] 周國輝，張曙光，鄒壽發，等.水稻新病害南方水稻黑條矮縮病發生特點及為害趨勢分析[J].植物保護，2010，36（2）：235-238.