基因槍介導的轉基因小麥的獲得與鑒定

摘要：運用基因工程技術將外源抗病基因直接導入具有優良農藝性狀的小麥品種中，能夠獲得抗赤霉病小麥新品種。采用基因槍介導的共轉化法，以bar基因為篩選標記，將幾丁質酶基因導入長江中下游小麥栽培品種鄭麥9023，T0代經過PCR鑒定，獲得6株陽性植株，表明幾丁質酶基因已整合到小麥基因組中。

關鍵詞：小麥；赤霉病；基因槍轉化；幾丁質酶基因

中圖分類號：S512.1；Q785 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）05-1038-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.05.004

Abstract： Genetic engineering can directly introduce exogenous antifungal genes into elite wheat with to obtain new wheat varieties against FHB （Fusarium Head Blight）. Using bar as selection marker， trichoderma chitinase gene（UEch42） was introduced into immature embryos of Zhengmai 9023 by biolistic co-bombardment. PCR results showed that 6 transgenic plants were obtained in T0 generation， indicating that genes were integrated into wheat genome.

Key words： wheat； FBH （Fusarium Head Blight）； microprojectile bombardment； chitinase gene

小麥赤霉病（Fusarium Head Blight，FHB）是由禾谷鐮刀菌引起的禾谷類真菌病害，其致病菌主要在開花灌漿期侵染小麥的穗部，造成穗腐、粒腐，引起減產，甚至顆粒無收。禾谷鐮刀菌在侵染小麥的過程中會產生單端孢霉烯族毒素（Trichothecenes，單族毒素），會滯留在子粒上進入食物鏈，從而引起食品安全問題，危及人畜健康，近年來隨著氣候的變暖，小麥赤霉病在北美和歐洲大陸也時有大面積發生，這嚴重影響著小麥生產區的糧食安全。

可是，到目前為止，世界上還沒有發現完全抗赤霉病的小麥品種，抗赤霉病育種工作已經開展了很多年，主要集中在傳統育種方面[1]，但是傳統育種耗時費力，獲得的小麥品種抗性單一，抗性遺傳基礎狹窄[2]，利用轉基因技術將赤霉病抗性基因轉入小麥栽培品種，豐富小麥中的抗真菌性病害基因，加快育種進程，大大提高育種效率和抗病效果，不失為一種有效獲得抗性小麥品種的重要途徑。

研究表明，幾丁質是一種廣泛分布于多數真菌細胞壁上的主要成分。它是N-乙酰-D-葡萄糖胺以β-1，4-糖苷鍵連接的多聚物。植物中的N-乙酰葡萄糖胺以糖酯鍵形式存在，而非線性同聚物，即植物中缺少該酶的有效底物。所以幾丁質酶可以降解病原真菌細胞壁中的幾丁質，破壞細胞新物質的沉積致使病原體死亡，而且產生的細胞壁碎片具有誘導作用，從而刺激寄主植物的抗病反應。通過基因工程的手段將幾丁質酶基因轉入小麥中，使小麥獲得分泌幾丁質酶（Chitinase）的能力。當禾谷鐮刀菌入侵小麥時，轉基因小麥分泌的幾丁質酶可將此真菌的細胞壁分解，抑制真菌的侵染和繁殖，從而達到抗病的效果。

1992年Vasil等[3]采用基因槍技術獲得了第一株轉基因小麥，隨后，Weeks等[4]利用基因槍技術將 gus和bar基因導入了小麥，建立基因槍轉化小麥的技術體系。目前，基因槍轉化體系日益成熟，在小麥遺傳轉化方法中起著舉足輕重的作用[5，6]。基因槍法與其他轉化方法相比，具有許多優點：受體材料來源廣泛，無宿主限制，它避免了原生質體培養再生植株困難的問題以及農桿菌的宿主范圍限制；具有可控性高、操作簡便、快速、靈活等特點，從而實現多基因共轉化[7]。到目前為止，基因槍法運用最小表達框進行小麥遺傳轉化成為應用最為廣泛的方法[8-11]。

本研究采用基因槍共轉化的方法，利用bar基因作為篩選標記基因，將含有幾丁質酶基因用于基因槍轉化，以期獲得含有幾丁質酶基因的轉基因小麥，并探索利用幾丁質酶基因改良小麥抗赤霉病性狀的可行性，對小麥提高赤霉病抗性研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用小麥品種鄭麥為9023，質粒為pXJC- ch42、pBar。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養基配制 培養基成分參考文獻[12]。

1.2.2 外植體選擇 取開花后12～14 d的麥穗，剝取麥穗中間部位比較飽滿的體被白色絨毛呈嫩綠色的未成熟幼胚，用70%乙醇消毒30 s，無菌水快速沖洗1次，0.1%氯化汞消毒6～8 min，無菌水沖洗3～5次，每次2 min；在無菌條件下剝取半透明狀的幼胚，接種于愈傷誘導培養基中，放于27 ℃培養后用于轉化，挑選呈淡黃色，顆粒狀，較致密的愈傷轉至高滲培養基作高滲處理。

1.2.3 基因槍轟擊方法與參數 利用Bio-Rad公司生產的PDS-1000型高壓氦氣基因槍。轟擊參數：壓力7.58 Mpa，距離 9 cm，真空度93.13 kPa，轟擊次數1次，每槍金粉用量為250 μg，DNA用量為 1.5 μg，根據Bio-Rad公司基因槍使用說明書提供的方法轟擊，轟擊后繼續高滲暗處理16 h。

1.2.4 恢復培養及篩選 轟擊后的愈傷繼續高滲 16～20 h，然后轉入恢復培養基于 27 ℃中培養，根據愈傷組織在恢復培養基上生長的狀態，愈傷組織快速增殖開始出現大量胚狀體的時候，即可轉入分化篩選培養基。將恢復后的胚性愈傷組織轉入分化篩選培養基，待愈傷分化出抗性綠芽后轉入再生篩選培養基，將生長狀態良好的綠苗轉入生根篩選培養基。將生根篩選后存活的苗轉入壯苗培養基中壯苗，隨時觀察苗的狀態。當幼苗明顯變綠，根系較發達時即可置于4 ℃春化，移栽至溫室。

1.2.5 轉基因植株的PCR檢測 用CTAB法提取小麥幼嫩葉片基因組DNA。對目的基因進行PCR檢測。以dd H2O和未轉化的同一品種植株DNA作陰性對照進行PCR擴增，可以擴增出408 bp的特異性片段。PCR儀為MJ-100型，反應條件為：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性40 s，61 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，35個循環；72 ℃延伸10 min，10 ℃10 min終止反應。

2 結果與分析

2.1 小麥轉bar基因植株篩選

取開花后12～14 d的麥穗，剝取麥穗中間部位比較飽滿的體被白色絨毛呈嫩綠色的未成熟幼胚（圖1A），在無菌條件下剝取半透明狀的幼胚，接種于愈傷誘導培養基中（圖1B），挑選呈淡黃色，顆粒狀，較致密的愈傷轉至高滲培養基，置于小皿中央的圓圈內高滲處理4～6 h（圖1C），轟擊后的愈傷繼續高滲 16～20 h，然后轉入恢復培養基于 27 ℃培養（圖1D），恢復培養后愈傷組織快速增殖出現大量胚狀體（圖1E），將恢復后的胚性愈傷組織轉入分化篩選培養基分化篩選 （圖1F），分化篩選后愈傷分化出綠點（圖1G），將長出的綠苗分成單株，轉入生根篩選培養基篩選，得到部分抗性組培苗（圖1H），將生根篩選后存活的苗轉入壯苗培養基中，隨時觀察苗的狀態。當幼苗明顯變綠，根系較發達時即可置于4 ℃春化，移栽至溫室（圖1I）。

2.2 轉基因植株的PCR鑒定

取鄭麥9023 T0代植株的幼嫩葉片，用CTAB 法提取小麥葉片DNA，用幾丁質酶基因的特異引物LI/UER對抗性植株進行PCR鑒定，鄭麥9023在T0代獲得6株陽性植株（表1，圖2），表明幾丁質酶基因已整合到小麥基因組中。

3 小結與討論

幾丁質又稱殼多糖，是由N-乙酰葡萄糖胺通過β連接聚合而成的結構同多糖。廣泛存在于自然界中，是真菌類細胞壁的主要成分。通過基因工程的手段將幾丁質酶基因轉入小麥中，使小麥獲得分泌幾丁質酶（Chitinase）的能力。當禾谷鐮刀菌入侵小麥時，轉基因小麥分泌的幾丁質酶可將此真菌的細胞壁分解，抑制真菌的侵染和繁殖，從而達到抗病的效果。在本研究中，幾丁質酶基因具有廣譜抗菌功能，能抑制十幾種病原菌和非病原真菌的生長及孢子萌發，其幾丁質結合區對細胞壁的高親和力導致其強烈的抑菌效果。T0代經PCR鑒定，獲得6株陽性植株，表明幾丁質酶基因已經整合到小麥基因組中。

bar基因是從吸水鏈霉菌（Streptomyce hygroscopicus）中分離出來的，編碼膦絲菌素乙酰轉移酶（Phosphinithricin acetlyltransferase，PAT），PAT能夠催化PPT的游離氨基乙酰化，乙酰化的PPT無法抑制GS活性，從而對PPT起到解毒作用[13]。含有bar基因的植物具有對Bialaphos的抗性，因此，bar基因可作為選擇性標記基因，利用其在轉化植物體內中的表達，只要在篩選培養基中加入一定劑量的 Bialaphos，就會殺死非轉化細胞，而生存下來的就是含有標記基因的轉化細胞。在Bialaphos篩選體系獲得抗性植株164株，經PCR鑒定，T0代才獲得轉基因小麥植株6株。這種在Bialaphos篩選體系下抗性苗多而陽性苗少的現象，可能是由于植物細胞本身具有一定的耐受性和抗逆性，非轉化細胞即使在高濃度的篩選劑篩選中也出現逃逸現象，產生假轉化體，還有可能是由于某些轉化組織的解毒能力很強，能夠使最接近的非轉化組織得到交叉保護[14]。

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