新疆紅地球葡萄葉中五種成分含量的測定

摘要：采用比色法和考馬斯亮藍法分別對新鮮葡萄葉中多酚和蛋白質含量進行測定。采用滴定法、比色法分別對新疆紅地球葡萄葉片供試粉末中有機酸、皂苷及黃酮的含量進行測定。結果表明，新鮮葡萄葉片中多酚含量為0.37%，蛋白質含量為1.01%。葡萄供試粉末中有機酸含量為1.59%，皂苷含量為1.11%，黃酮含量為0.50%。葡萄葉片中蛋白質含量豐富，其他4種生物活性物質成分含量高，可以作為一種可開發資源進行深入研究。

關鍵詞：葡萄葉；有機酸；多酚；皂苷

中圖分類號：S663.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）21-1190-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.05.041

Abstract： The contents of polyphenol and protein in leaves of fresh grape were determined by colorimetry and Bradford method. The contents of organic acid， soap glucoside， flavanone in grape were detected using titration and colorimetry. The results showed that there were 0.37% polyphenol， 1.01% protein in leaves of fresh grape， and 1.11% soap-glucoside， 0.50% flavanone， 1.59% organic-acid in grape leaves. The content of protein and the other four kinds of biological active were high in the grape leaves. It can be futher studied and used as a natural source of drug.

Key words： grape leves； organic acid； polyphenol； soap glucoside

葡萄的根、果、藤均可入藥，葡萄葉有安胎、消腫、利尿的作用。在土耳其、希臘及中東一帶，葡萄葉大都作為烹飪材料，其中最有名的菜是多馬西（Dolmasi），是一種以葡萄葉包米和絞肉的菜肴。在新疆地區，生產建設兵團農十三師生產加工出口的無核白葡萄葉片投入至中東市場后獲得了較好的經濟效益。

葡萄是新疆的主要經濟作物，是種植面積廣的一種有生資源。截至2012年新疆葡萄種植面積達到12.56萬hm2，占全國種植面積的27%[1]。新疆葡萄品種資源豐富，有600多個品種，有一定種植面積的品種有將近20種，其中紅地球由于其優良的口感，作為鮮食葡萄品種在新疆大面積種植，僅新疆農五師就擁有6個紅地球葡萄種植團[2]。葡萄的種植面積逐年增加，為了保證果實的質量，葡萄種植期間需要多次除去植株外周葉片。以新疆北疆昌吉至石河子葡萄產區為例，長期以來葡萄葉資源大多用于釀酒工業和食用，而產生的廢棄物大多被焚燒，不但造成資源浪費，還污染環境，造成了一定的資源損耗和經濟浪費。對廢棄的葡萄葉的研究可以使生態資源得到有效利用。

課題組前期利用高相液相色譜法檢測到新疆紅地球葡萄葉中總茋類化合物含量為34.77 mg/kg[3]。本試驗選取新疆秋季廢棄的紅地球葡萄葉，對其中5種活性成分（有機酸、黃酮、多酚、皂苷和蛋白質）的含量進行測定，對明確資源價值、評價適用性作為參考。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

在石河子秋季生長健壯、長勢較一致紅地球葡萄葉中，選取10月齡、大小相近的離體葡萄葉片（含葉柄），用去離子水洗凈、擦干。

沒食子酸、蘆丁、葫蘆素標準品購于寶雞市辰光生物科技有限公司（純度≥98%）；牛血清白蛋白標準品購于Sigma公司（純度≥98%）；95%乙醇（分析純）購于天津市富宇精細化工有限公司。

主要儀器包括UV2450型紫外-可見分光光度計（日本島津公司）；KQ-5200DE型數控超聲波清洗器（昆明市超聲儀器有限公司）；EYELA旋轉蒸發儀SB-1000（上海愛朗儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 葡萄葉中水分含量測定 采用鮮質量法測定葡萄葉片含水量和相對含水量[4]，隨機取30片大小一致、葉齡相近的葉片，從葉基部剪下，用去離子水洗凈，擦拭掉葉片表面多余水分并稱量鮮質量（初始鮮質量）。經105 ℃ 30 min 殺青后，75 ℃烘至恒質量，稱重（干質量）并計算其葉片含水量。

葉片含水量=（初始鮮質量-干質量）/初始鮮質量×100%。

1.2.2 葡萄葉中有機酸的樣品制備 將離體葡萄葉置105 ℃的烘箱中烘4 h，取出冷卻，研成細粉，放干燥器中備用。精密稱取烘干至恒重的葡萄葉粉末2 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入0.05 mol/L NaOH 溶液100 mL，密塞，室溫放置0.5 h，抽濾，備用[5]。

1.2.3 葡萄葉中多酚、皂苷和黃酮的樣品制備 準確稱取新鮮離體葡萄葉片20 g，按料液比1∶5（W/V）的比例用50 %乙醇超聲60 min，溫度為70 ℃，過濾，提取2次[6]。用旋轉蒸發儀濃縮提取液，得新疆紅地球葡萄葉多酚粗提液。將離體葡萄葉片烘干、粉碎、過篩，稱取10 g粉末，按料液比1∶15（W/V）的比例用70%乙醇回流提取2 h，溫度為70 ℃[7]。用旋轉蒸發儀濃縮提取液，得新疆紅地球葡萄葉皂苷粗提液。將離體葡萄葉片烘干、粉碎、過篩，稱取10 g粉末，按料液比1∶40（W/V）的比例用45%乙醇回流提取2 h，溫度為60 ℃[8]。用旋轉蒸發儀濃縮提取液，得新疆紅地球葡萄葉黃酮粗提液。

1.2.4 葡萄葉中蛋白質的樣品制備 準確稱取葡萄葉片1 g，用 3 mL 0.1 mol/L PBS溶液（pH 6.8）進行勻漿抽提，于4 ℃條件下浸泡4 h，10 000 r/min離心18 min，上清液為蛋白質粗提液[9]。

1.2.5 葡萄葉片中化學成分的定性分析 將上述5種提取液，按照常規化學成分的定性檢測方法進行檢測。

1.2.6 葡萄葉中有機酸含量測定方法 精密吸取25 mL有機酸樣品溶液3份于250 mL三角燒瓶中，分別加入去離子水25 mL、酚酞指示劑2滴，用0.05 mol/L 鹽酸溶液進行滴定。記錄溶液紅色褪去時消耗標準酸溶液體積（mL），并計算平均值。同時滴定0.05 mol/L NaOH 溶液25 mL，記錄空白溶液消耗標準酸溶液體積（mL） ，并計算平均值。計算葡萄葉片中有機酸的含量。

1.2.7 沒食子酸的標準曲線制定 采用福林酚法[10]，精密稱取沒食子酸對照品3.00 mg，置于10 mL容量瓶中，去離子水定容，搖勻，得沒食子酸標準品溶液。精確吸取沒食子酸標準品溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，分別加入1 mL福林酚試劑和3 mL 7.5% Na2CO3溶液，去離子水定容至10 mL。室溫避光放置90 min后，以第一管試劑作空白，進行全波長掃描， 結果在650 nm處有最大吸收峰。于650 nm處分別測定其吸光度。以沒食子酸濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.8 葫蘆素B的標準曲線制定 比色法是測定皂苷最常用的方法，利用皂苷與一些試劑反應后顯色，可在一定波長處進行測量。本試驗采用香草醛-高氯酸作為顯色劑，測定新疆紅地球葡萄葉中皂苷的含量。精密稱取3 mg葫蘆素B標準品，定容至10 mL，去離子水定容，搖勻，得葫蘆素標準品溶液。精確吸取葫蘆素標準品溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液，再加入0.8 mL高氯酸溶液，于70 ℃恒溫加熱20 min，取出后冰水浴冷卻5 min，加冰醋酸5 mL，搖勻，以第一管試劑作空白，進行全波長掃描， 結果在463 nm 處有最大吸收峰。于463 nm處分別測定其吸光度。以葫蘆素B濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.9 蘆丁的標準曲線制定 黃酮類物質利用鋁離子與其3，4-二羥基發生絡合反應顯色來進行測定，顯色劑選取亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉溶液。精密稱取3 mg蘆丁標準品，去離子水定容至10 mL，搖勻，得蘆丁標準品溶液。精確吸取蘆丁標準液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，分別置于10 mL容量瓶中， 加 5% NaNO2溶液0.3 mL， 放置6 min， 再加 10% Al（NO3）3溶液0.3 mL， 放置6 min， 加4% NaOH溶液4. 0 mL， 加水至刻度， 搖勻， 放置15 min， 以第一管試劑作空白，進行全波長掃描， 結果在500 nm 處有最大吸收峰。以蘆丁濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.10 牛血清白蛋白的標準曲線制定 根據蛋白質與染料相結合的原理設計?？捡R斯亮蘭G-250染料在酸性溶液中與蛋白質結合， 使染料的最大吸收峰的位置由465 nm變為595 nm，溶液的顏色由棕黑色變為藍色， 可在595 nm處進行比色測定[11]。準確稱取牛血清白蛋白100.0 mg，用去離子水定容至100 mL，即為1 mg/mL 蛋白質標準液，4 ℃保存待用。分別吸取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL標準蛋白質溶液于10 mL試管中，各管補加0.15 mol/L 氯化鈉溶液至1 mL，各取0.1 mL于新試管，然后加入5 mL考馬斯亮藍G-250溶液，搖勻，放置2 min，于595 nm處測定其吸光度，繪制標準曲線。

1.2.11 葡萄葉中多酚、皂苷、黃酮和蛋白質含量測定 取新疆紅地球葡萄葉多酚粗提液采用“1.2.7”法測定650 nm處吸光度，計算葡萄葉中總酚的質量分數。 取新疆紅地球葡萄葉皂苷粗提液采用“1.2.8”法測定463 nm處吸光度，計算葡萄葉中皂苷的質量分數。取新疆紅地球葡萄葉黃酮粗提液采用“1.2.9”法測定500 nm處吸光度，計算葡萄葉中黃酮的質量分數。取新疆紅地球葡萄葉蛋白質粗提液采用“1.2.10”法測定595 nm處吸光度，計算葡萄葉中蛋白質的質量分數。

1.2.12 精密度，重復性及穩定性試驗 精密度試驗：精密吸取0.5 mL的4種標準品各5份，按相應方法進行測定，計算；重復性試驗：精密稱取4種標準品各5份，按上述處理方法平行操作測定，計算；穩定性試驗：各取4種標準品，每隔0.5 h測定吸光值，共5次。

2 結果與分析

2.1 葡萄離體葉片初始鮮質量、干質量和葡萄葉片含水量

葉片含水量指葉片中的水分占葉片總質量的百分比。經計算葉片中平均含水量達到77.22%，見

表1。

2.2 5種化學成分定性檢測結果

通過對葡萄葉片進行化學成分定性檢測，表明葡萄葉片中含有有機酸、酚類、皂苷、黃酮類物質和蛋白質，見表2。

2.3 葡萄葉中有機酸含量測定結果

新疆紅地球葡萄葉片粉末供試品中有機酸平均含量達到15.87 mg/g，根據已測葉片含水量77.22%，估算得出新鮮紅地球葡萄葉片中有機酸含量為3.62 mg/g。

2.4 線性關系考察、精密度，重復性及穩定性試驗結果

沒食子酸、葫蘆素B、蘆丁和牛血清白蛋白4種標準品的標準曲線如表4所示，相關系數為0.999 1～0.999 3，表明在設定濃度范圍內，線性關系良好。精密度、重復性和穩定性均在5%以下。

2.5 葡萄葉中多酚、皂苷、黃酮和蛋白質含量

新疆紅地球葡萄葉片中多酚和蛋白質采用新鮮葉片測定，一定程度避免其分解。經測定，多酚含量達到3.70 mg/g，蛋白質含量達到10.11 mg/g。

皂苷和黃酮的含量采用烘干后葡萄葉片粉末測定，排除水分干擾。皂苷含量為11.09 mg/g，黃酮含量為4.95 mg/g。根據所測含水量換算成鮮重含量，其中新鮮葉片中皂苷含量為2.52 mg/g，黃酮含量為1.13 mg/g（表5）。

2.6 葡萄葉提取液中多酚、皂苷、黃酮和蛋白質加樣回收率

各取已知含量的葡萄葉多酚、皂苷、黃酮和蛋白質提取液，分別加入對應標準品沒食子酸、葫蘆素B、蘆丁和牛血清白蛋白，在相應測定方法下測定吸光度。計算回收率，見表6至表9。4種測定方法的回收率較好，達到了測定要求。

2.7 葡萄葉片中5種活性成分比例分布

根據所測的新疆紅地球葡萄葉片含水量，將葉片中的有機酸、皂苷和黃酮的含量換算成鮮重比例，與測得的多酚和蛋白質含量進行比較。結果表明在測定的5種活性成分中，有機酸、蛋白質占了絕大部分的比例，分別為48%和30%，接下來依次為多酚、皂苷、黃酮（圖1）。

3 小結與討論

葡萄中含有的有機酸、多酚及黃酮等物質具有抗腫瘤、抑菌、抗氧化、降血脂等廣泛的生物活性。Landrault等[12]和Bavaresco[13]等發現葡萄葉、莖、果實中一些特殊活性的茋類物質，具有潛在利用價值。文獻[14]對葡萄子組成成分及各組分含量進行了研究，發現其中所含的化學成分具有很強的清除自由基的能力。前期工作也表明葡萄葉中含有豐富的茋類化合物，美國紅提中的白藜蘆醇含量達到3.34 μg/g，白藜蘆醇苷的含量達到23.73 μg/g[3]。

葡萄葉來源于自然，安全無害，是一種傳統中藥材， 可治療嘔吐、水腫、小便不利、目赤等癥[15]。新疆葡萄葉資源豐富，但是目前國內研究報告較少。本研究對新疆紅地球葡萄葉片中5種生物活性成分進行測定，為葡萄葉的開發利用提供理論依據。測定結果表明，新疆紅地球葡萄葉中有機酸、蛋白質、多酚、皂苷和黃酮，含量分別為0.36%、1.01%、0.37%、0.25%、0.11%。由圖1可看出測定的5種活性成分中，有機酸含量最高，這與葡萄中含有大量的蘋果酸、酒石酸和檸檬酸有關[16]。葉片中蛋白質占1.01%，折合干重含量為3.62 mg/g，占干重比例的4.43%，與植物大豆21.04%相比較低，與禾本科水稻5.55%接近[17]。葡萄葉中蛋白含量豐富，可以作為飼料添加劑，國內外大量飼養試驗表明植物蛋白質具有明顯的增加胴體重量、改善禽魚肉蛋等產品質量、降低飼料消耗率等作用。從圖1中也可以看出葡萄葉片中皂苷、多酚和黃酮含量也十分豐富。

隨著研究不斷深入，有機酸具有的抗腫瘤、抑菌、抗血栓、抗艾滋病毒、降血脂等功效逐步被發現[18]，其提取成為了研究熱點。而葡萄葉片中有機酸含量高達3.62 mg/g，可以作為一種天然的提取分離物；本研究測定發現新鮮新疆紅地球葡萄葉中多酚含量為3.70 mg/g，雖然與葡萄皮渣（42.51±1.21） mg/g[6]相比含量偏低，但由于葡萄葉產量相對巨大、來源簡單，可以作為一種經濟的多酚提取物資源；在對黃酮和皂苷的含量測定中，發現黃酮類物質含量為1.13 mg/g，與已報道的吐魯番葡萄葉片黃酮含量5.33 mg/g[8]有一定差距。黃酮類物質是存在于自然界的一大類化合物，具有良好的藥理活性，具有抗腫瘤、抗脂肪氧化、抗衰老等重要作用[19]，而葡萄葉資源可以作為新的黃酮藥源；目前國內尚無對葡萄葉中皂苷含量進行報道，本研究測定皂苷含量為2.52 mg/g。皂苷不僅可以作為藥材發揮降血糖、抗氧化、提高免疫力等功效，還可以作為高級化妝品和食品添加劑使用，如殺菌劑、發泡劑、抗氧化劑等使用。葡萄葉片中含有豐富的有機酸、蛋白質、多酚、皂苷和黃酮，其作為天然的自然資源具有廣泛的開發前景和利用價值， 值得綜合利用和開發。

本研究測定了葡萄葉片中水分及有機酸、多酚、皂苷、黃酮和蛋白質的含量，但對于葡萄葉中其他物質如多糖、纖維素、果膠等成分受試驗條件所限尚未測定，所以反映的葡萄葉片成分含量還不夠全面，有待今后進步一步研究。本研究可為今后進一步研究葡萄葉片中成分及其綜合利用提供可借鑒的依據。

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