油橄欖不同品種葉片中總黃酮提取工藝的比較

摘要：以油橄欖（Olea europaea L.）葉片為原料，以蘆丁為對照品，先通過單因素試驗(yàn)、再采用正交試驗(yàn)優(yōu)選總黃酮提取工藝，確定分光光度法作為測定方法，其選用AlCl3作為顯色劑，在波長415 nm、顯色時(shí)間15 min條件下，對5個(gè)油橄欖品種葉片中的總黃酮提取量進(jìn)行測定比較。結(jié)果表明，最佳提取工藝為提取溶劑90%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇、提取溫度60 ℃、料液比1∶19、回流時(shí)間1.5 h。不同品種油橄欖葉片中總黃酮的提取量并不相同，在皮瓜爾（O. europaea cv. Picual）、科拉蒂（O. europaea cv. Coratina）、萊星（O. europaea cv. Leecio）、佛奧（O. europaea cv. Frantoio）、配多靈（O. europaea cv. Pendollin）5個(gè)品種中，以科拉蒂的葉片總黃酮提取量最高，萊星的含量最低。通過比較不同品種油橄欖葉片中總黃酮提取量的高低，為油橄欖葉片總黃酮的生產(chǎn)和應(yīng)用提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)支撐，也將為當(dāng)?shù)氐挠烷蠙炀C合開發(fā)提供技術(shù)保障。

關(guān)鍵詞：油橄欖（Olea europaea L.）；葉片；總黃酮；提取工藝；提取量

中圖分類號：S565.7；Q944.56；O629 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）06-1412-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.06.033

Abstract： The technology of extracting total flavonoids from Olea europaea L. leaves was optimized with single-factor experiment and orthogonal experiment using rutin as control. The contents of total flavonoids in leaves of five O. europaea varieties were compared with spectrophotometry using AlCl3 as chromogenic agent under the wavelength of 415 nm and chromogenic time of 15 min. The results showed that the optimal conditions were 90% ethanol， 60 ℃， material to solvent ratio of 1∶19， refluxing extraction time of 1.5 h. Contents of total flavonoids were different in leaves of different olive varieties. Among O. europaea cv. Picual， O. europaea cv. Coratina， O. europaea cv. Leecio， O. europaea cv. Frantoio， O. europaea cv. Pendollin， the content of total flavonoids in O. europaea cv. Coratina was the highest， while the lowest in O. europaea cv. Leecio. It will provide experimental basis for producing and utlizing flavonoids in leaves of O. europae， and technical support for comprehensively developing the local olive.

Key words： Olea europaea L.； leaf； the total flavonoids； extraction process； content

油橄欖（Olea europaea L.）又名洋橄欖、齊敦果，為木犀科（Oleaceae）木犀欖屬（Olea L.）常綠闊葉喬木，其栽培種具有較高的食用價(jià)值，可提煉優(yōu)質(zhì)食用植物油——橄欖油[1]。自20世紀(jì)60年代起，油橄欖開始在中國引種，其中甘肅省隴南市武都區(qū)是目前全國最大的油橄欖種植基地，現(xiàn)保存并培育有多個(gè)品種，如佛奧（O. europaea cv. Frantoio）、萊星（O. europaea cv. Leecio）、配多靈（O. europaea cv. Pendollin）、科拉蒂（O. europaea cv. Coratina）、皮肖利（O. europaea cv. Picholine）、戈達(dá)爾（O. europaea cv. Gordal）、九峰6號（O. europaea cv. Jiufeng No.6）、皮瓜爾（O. europaea cv. Picual）、阿斯（O. europaea cv. Ascolano）、格羅莎（O. europaea cv. Grossa）、鄂植8號（O. europaea cv. E-zhi No.8）、中山24號（O. europaea cv. Zhongshan 24）、城固32號（O. europaea cv. Chenggu 32）等。在四川省境內(nèi)，從油橄欖的生存生態(tài)條件要求氣候指標(biāo)如氣溫、降水、空氣濕度、日照等方面來分析，西昌地區(qū)是比較適宜油橄欖發(fā)展的區(qū)域。當(dāng)?shù)匾延薪?0年油橄欖引種栽培的歷史，在油橄欖品種引進(jìn)、篩選方面做了大量的工作，初步具備了采用優(yōu)良品種進(jìn)行生產(chǎn)栽培的基礎(chǔ)條件[2]。但是油橄欖的果渣、榨油廢水和葉片等廢棄物的利用還是空白，綜合利用還有待開發(fā)。據(jù)報(bào)道，油橄欖葉片中的活性成分主要是有機(jī)酸、蛋白質(zhì)、氨基酸、黃酮類物質(zhì)等[3]；然而油橄欖品種繁多，雖然不同的品種其葉片中所含的活性成分大致相同[4]，但活性成分的含量是否一致還未見報(bào)道。因此有必要對不同品種油橄欖葉片進(jìn)行活性成分的含量檢測，以期為油橄欖葉片的合理利用提供理論基礎(chǔ)。鑒于此，試驗(yàn)采用單因素、正交試驗(yàn)方法，優(yōu)選出最佳提取油橄欖葉片中總黃酮的工藝；然后在最佳提取工藝條件下，對5個(gè)油橄欖品種葉片中的總黃酮進(jìn)行了測定分析與比較，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

試劑有無水三氯化鋁（AR）、95%（體積分?jǐn)?shù)，下同）乙醇，以蘆丁為對照品，都為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司出品。

參試儀器主要有722S可見光分光光度計(jì)（上海菁華科技儀器有限公司）、98-1-BWAY-2S電子調(diào)溫電熱套（天津市泰斯特有限公司）、SHZ-Ⅲ循環(huán)水真空泵（上海亞榮生化儀器廠）、HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司）、ZN-400A微型高速粉碎機(jī)（長沙市中南制藥廠）、ETTLERAE 240電子天平（瑞士METTLER公司）。

植物材料有油橄欖葉片，由涼山州國家油橄欖良種基地提供，品種為皮瓜爾、科拉蒂、萊星、佛奧、配多靈。將采摘的各品種油橄欖葉片置于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)自然陰干，干燥后的油橄欖葉片于微型高速粉碎機(jī)中粉碎，然后放在干燥器皿中備用。

1.2 總黃酮的測定

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 用蘆丁對照品制備蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，從蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.079 2 mg/mL）中分別精確移取 0.0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 mL置于25 mL容量瓶中，都加30%乙醇至12.5 mL，搖勻，再分別加入10 mL 1%的AlCl3溶液，用30%乙醇定容至刻度，搖勻，放置15 min后，在415 nm下測定溶液的吸光度值；以濃度-吸光度進(jìn)行回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程。

1.2.2 總黃酮測定 對5個(gè)品種油橄欖葉片按最佳提取工藝條件提取總黃酮后，分別取各樣品溶液2.5 mL，置于25 mL容量瓶中，加入30%乙醇至12.5 mL，搖勻，再分別加入10 mL 1 %的AlCl3溶液，用30%乙醇定容至刻度，搖勻后放置15 min，于415 nm下測定吸光度值[5]，計(jì)算總黃酮的提取量。

1.3 單因素試驗(yàn)

1.3.1 乙醇濃度對油橄欖葉片總黃酮提取量的影響

稱取10 g油橄欖葉片樣品置于250 mL圓底燒瓶中，分別用60%、70%、80%、90%、95%的乙醇為溶劑，在提取溫度為80 ℃、料液比為1∶13的條件下，水浴加熱回流2 h，真空抽濾2次，常壓蒸餾回收乙醇，濃縮液用去離子水定容至250 mL，靜置沉降24 h后，取上清液10 mL，用60%乙醇定容至100 mL，即樣品溶液。取樣品溶液2.5 mL按“1.2.2”的方法測定樣品溶液的吸光度值，并計(jì)算總黃酮的提取量。

1.3.2 提取溫度對油橄欖葉片總黃酮提取量的影響

稱取10 g油橄欖葉片樣品，用90%乙醇溶解，料液比1∶13，分別在40、50、60、70、80 ℃的條件下水浴加熱回流2 h，按“1.3.1”的方法測定樣品溶液的吸光度值，并計(jì)算總黃酮的提取量。

1.3.3 料液比對油橄欖葉片總黃酮提取量的影響

稱取10 g油橄欖葉片樣品，用90%乙醇溶解，分別在料液比為1∶13、1∶15、1∶17、1∶19、1∶21的條件下進(jìn)行總黃酮提取，溫度都控制在70 ℃，水浴加熱回流2 h，按“1.3.1”的方法測定樣品溶液的吸光度值，并計(jì)算總黃酮的提取量。

1.3.4 回流時(shí)間對油橄欖葉片總黃酮提取量的影響

稱取10 g油橄欖葉片樣品，在90%乙醇、料液比1∶19、提取溫度70 ℃條件下，分別回流1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，再按“1.3.1”的方法測定樣品溶液的吸光度值，并計(jì)算總黃酮的提取量。

1.4 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以乙醇濃度、提取溫度、料液比、回流時(shí)間作為考察因素，以測定的油橄欖葉片中總黃酮的提取量為考察指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)方法對樣品中的總黃酮進(jìn)行提取，以總黃酮提取量為指標(biāo)進(jìn)行試驗(yàn)優(yōu)化，來確定最佳的提取工藝條件。L9（34）正交試驗(yàn)各因素、水平設(shè)置見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 試驗(yàn)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。以濃度-吸光度進(jìn)行回歸所得到的線性回歸方程為y=29.904x+0.013 8，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6。

2.1.2 乙醇濃度對油橄欖葉片總黃酮提取量的影響 乙醇濃度對油橄欖葉片總黃酮提取量的影響結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，乙醇濃度較低時(shí)，總黃酮提取量也較低，說明對原料的提取不夠完全；而乙醇濃度太大時(shí)可能使一些脂溶性的雜質(zhì)溶解增加，從而影響了黃酮類化合物的溶出。所以乙醇濃度為90%（體積分?jǐn)?shù)）時(shí)，油橄欖葉片中總黃酮的提取量最大。因此選擇90%的乙醇為提取溶劑。

2.1.3 提取溫度對油橄欖葉片總黃酮提取量的影響

提取溫度對油橄欖葉片總黃酮提取量的影響結(jié)果見圖3。從圖3可見，油橄欖葉片總黃酮的提取量隨提取溫度的升高而逐漸增加，在提取溫度為70 ℃時(shí)提取量最高，70 ℃以后又逐漸降低。分析顯示，在40～70 ℃的范圍內(nèi)隨著溫度升高，分子運(yùn)動(dòng)加快，溶質(zhì)分子與溶劑分子能夠充分接觸，可使黃酮類化合物更容易地溶解到溶劑中；而超過70 ℃后隨著熱效應(yīng)的影響，雜質(zhì)的溶出量開始增加，一些活性成分也會被破壞，所以綜合考慮提取溫度宜在70 ℃左右。

2.1.4 料液比對油橄欖葉片總黃酮提取量的影響

料液比對油橄欖葉片總黃酮提取量的影響結(jié)果見圖4。從圖4可以看出，隨著料液比的減少總黃酮的提取量逐漸增高，在1∶17時(shí)提取量最高，而在1∶19～1∶21提取量呈現(xiàn)降低趨勢。當(dāng)料液比達(dá)到一定比例時(shí)，黃酮類成分已基本溶出，再減少料液比，可能由于總黃酮被反應(yīng)消耗了，反而降低了總黃酮的提取效果。同時(shí)隨著溶劑量的增加，回收試劑的能耗就越高，不利于提高經(jīng)濟(jì)效應(yīng)。因此選擇料液比為1∶17。

2.1.5 回流時(shí)間對油橄欖葉片總黃酮提取量的影響

回流時(shí)間對油橄欖葉片總黃酮提取量的影響結(jié)果見圖5。由圖5可以看出，隨著回流時(shí)間的延長，黃酮類化合物的提取量先上升后下降。在 1～2 h內(nèi)上升趨勢明顯，2 h達(dá)到最大值，2 h之后有下降趨勢。說明剛開始時(shí)由于時(shí)間較短、黃酮類物質(zhì)與溶劑還沒充分反應(yīng)溶出，所以在2 h時(shí)剛好達(dá)到溶出平衡，使提取量最高；而時(shí)間超過2 h后，溶劑的揮發(fā)導(dǎo)致乙醇濃度降低或者雜質(zhì)溶解增加，進(jìn)而影響了黃酮類化合物的溶出，使黃酮類化合物的提取量有所下降。因此選擇回流時(shí)間為2 h。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

L9（34）正交試驗(yàn)提取油橄欖葉片總黃酮的比較結(jié)果見表2。從表2分析可知，乙醇濃度、提取溫度、料液比和回流時(shí)間這4個(gè)因素對油橄欖葉片總黃酮提取量影響的主次順序?yàn)橐掖紳舛取⒘弦罕取⑻崛囟取⒒亓鲿r(shí)間，根據(jù)正交試驗(yàn)得出的最佳提取條件為乙醇濃度90%、提取溫度60 ℃、料液比1∶19、回流時(shí)間1.5 h。

2.3 不同品種油橄欖葉片中的總黃酮提取量測定

在乙醇濃度90%、提取溫度60 ℃、料液比1∶19、回流時(shí)間1.5 h的最佳提取條件下。測定皮瓜爾、科拉蒂、萊星、佛奧、配多靈5個(gè)油橄欖品種葉片的總黃酮含量，結(jié)果見表3。從表3可見，以科拉蒂的葉片總黃酮含量最高，萊星的含量最低。

2.4 加標(biāo)回收試驗(yàn)

稱取10 g油橄欖各品種葉片樣品粉末，用90%乙醇為溶劑，然后在提取溫度60 ℃，料液比1∶19的條件下，水浴加熱回流1.5 h，真空抽濾2次，常壓蒸餾回收乙醇，濃縮液用去離子水定容至250 mL，靜置沉降24 h，各取上清液10 mL，用60%乙醇定容至100 mL。每個(gè)品種分別精密量取上述溶液2.5 mL，置于5個(gè)25 mL容量瓶中，加30%乙醇至12.5 mL，搖勻，再分別加入10 mL 1 %的AlCl3溶液，其中3份各加入1 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，用30%乙醇定容，搖勻放置15 min后，于415 nm處測定吸光度值，取均值，計(jì)算出加標(biāo)回收率，結(jié)果見表4。從表4可見，5個(gè)油橄欖品種葉片的加標(biāo)回收率在96.09%～101.01%，表明這個(gè)結(jié)果較為可信，所得到的葉片總黃酮含量也可觀，具有提取的價(jià)值。

3 小結(jié)

試驗(yàn)得出的油橄欖葉片中總黃酮最佳提取工藝為乙醇濃度90%（體積分?jǐn)?shù)）、提取溫度60 ℃、料液比1∶19、回流時(shí)間1.5 h。用此工藝對皮瓜爾、科拉蒂、萊星、佛奧、配多靈5個(gè)油橄欖品種葉片中的總黃酮進(jìn)行提取，其分光光度法的顯色劑為AlCl3，最大吸收波長在415 nm處，最佳顯色時(shí)間為15 min。結(jié)果表明，不同油橄欖品種葉片的總黃酮提取量并不相同，但差別不是很大，其中科拉蒂的葉片總黃酮提取量最高，其次分別為配多靈、佛奧、皮瓜爾、萊星，萊星的提取量最低；加標(biāo)回收率在96.09%～101.01%，表明這個(gè)結(jié)果較為可信，方法也簡單易操作，能為西昌地區(qū)油橄欖葉片中總黃酮的提取及應(yīng)用提供一定的試驗(yàn)基礎(chǔ)支撐，也將為當(dāng)?shù)氐挠烷蠙炀C合開發(fā)提供技術(shù)保障。

參考文獻(xiàn)：

[1] 白滿英，張金誠，崔育京.橄欖油的開發(fā)應(yīng)用[J].糧油食品科技， 2003，11（2）：31-33.

[2] 馬德華，王友芳.西昌地區(qū)油橄欖引種栽培的環(huán)境分析與評價(jià)[J].四川林業(yè)科技，2008，29（3）：43-46.

[3] 朱靜平.油橄欖葉中活性成份初步分析[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2012，51（15）：3315-3317.

[4] 朱靜平，劉 洪.2個(gè)品種油橄欖葉中活性成分分析[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（7）：317-318.

[5] 許 暉，孔蘭萍，張 斌，等.花生殼總黃酮乙醇提取工藝研究[J].食品工業(yè)科技，2007，28（8）：135-139.