牛結核分枝桿菌抗原蛋白Ag85B的表達及納米疫苗的制備

摘要：以牛結核分枝桿菌（Mycobacterium bovis，MTB）C68001株基因組DNA為模板，克隆免疫優勢抗原基因Ag85B，構建重組表達質粒pET-28a-ag85b，轉化入大腸埃希菌BL21（DE3），經IPTG誘導表達重組蛋白，對表達產物進行SDS-PAGE和Western blot分析。以明膠為佐劑，Ag85B為目的抗原制備納米疫苗，并對其進行了相關的工藝檢測。以BCA法建立測定蛋白質含量的標準曲線，在此基礎上檢測納米疫苗的載藥率和包封率。結果顯示，明膠佐劑疫苗的載藥率為71.83%，包封率為41.03%，符合納米疫苗的工藝要求。

關鍵詞：牛結核分枝桿菌（Mycobacterium bovis，MTB）；Ag85B抗原；原核表達；納米疫苗

中圖分類號：R392.11 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）06-1421-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.06.035

Abstract： The immuno-dominant antigen gene Ag85B was cloned using the genomic DNA of Mycobacterium bovis strain C68001 as template and used to construct the recombinant plasmid pET-28a-ag85b， transformed into E. coli BL21（DE3）. Induced by IPTG， the expressed recombinant protein was analyzed by SDS-PAGE and Western blot method. The nano-vaccine was prepared using gelatin as adjuvant and Ag85B as objective antigen. The related technology was tested. Based on the protein standard curve obtained with BCA method. The drug loading and encapsulation efficiency of the nano-vaccine was 71.83% and 41.03%， respectively， metting the technological requirements of nano-vaccine.

Key words： Mycobacterium bovis（MTB）， Ag85B antigen， prokaryotic expression， Nano-vaccine

牛結核病是由牛結核分枝桿菌（Mycobacterium bovis，MTB）引起的一種牛的慢性消耗性傳染病，該病可通過病畜傳染給人類或其他動物，嚴重影響畜牧業的可持續健康發展，并威脅人類的健康[1，2]。據2009年世界衛生組織（WHO）的調查報告顯示，全球每年新發結核病病例為800萬～1 000萬，有近300萬的患者死亡[3，4]。目前，中國是世界上結核病負擔最重的22個國家之一，是除印度之外的世界第二大結核病危害的重災區[5]。世界衛生組織專家早就指出，除非消滅牛結核病，否則人類結核病的控制是不會成功的。可見，結核病不僅嚴重影響畜牧業的健康穩定發展，造成了巨額的經濟損失，也嚴重危害著人類的健康。因此，為了控制牛結核病的傳播流行，亟待開發牛結核病的新型診斷試劑和預防制劑。卡介苗（BCG）是目前公認的預防結核病的惟一疫苗，但由于它的免疫保護效力不穩定，對人群的保護率介于0～80%之間[6]。而對于牛來講，接種BCG后，會干擾牛結核菌素（PPD）的檢測結果，導致不能區別人工免疫和自然感染，從而影響牛的檢疫和國際貿易。因此，為控制牛結核病的傳播流行，研制開發一種有效且高效的牛結核病新型疫苗迫在眉睫。

目前，亞單位疫苗雖然有副作用較小、可以明確組成成分等優點，但其成本較高，而且加強免疫需要佐劑的輔助。重組BCG疫苗有生長緩慢、培養要求高、轉化率較低等缺點。應用于DNA疫苗的載體有痘病毒載體和腺病毒載體，這些載體均屬于病毒類載體，雖然可有效地將外源基因轉入宿主細胞，但仍然存在著潛在的安全問題。以病毒作為載體具有不可控制的細胞毒性、對于刺激所產生的免疫反應的不可控以及缺乏區分感染細胞的能力等缺點，從而難于生產和包裝[7-9]。

由于納米粒子具有尺寸效應、表面效應、靶向作用和釋緩藥物、延長藥物作用時間等優點，利于刺激機體產生細胞免疫反應[10]。因而，納米疫苗的研制已成為生物技術領域的前沿和熱點之一[11，12]。

本試驗以明膠為載體材料，以卡波姆和Tween-80等為佐劑或表面活性劑，制備了載牛結核分枝桿菌免疫優勢抗原蛋白Ag85B的納米疫苗，并對其進行了相關的工藝檢測，旨在為下一步研究其免疫原性奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與載體 牛結核分枝桿菌C68001株基因組DNA、BL21（DE3）菌株、質粒載體pET-28a（+）由西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室保存。

1.1.2 試劑與儀器 SpectraTM Multicolor Low Range Protein Ladder購于Thermo公司；Western BrightTM ECL購于環亞生物科技有限公司；Anti-His標簽小鼠單克隆抗體、HRP-羊抗鼠IgG（H+L）、Protein Pure Ni-NTA Resin購于北京全式金生物技術有限公司；IPTG購自陜西省西安化玻站化學廠；丙烯酰胺、N，N′-甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸胺購自華美生物工程有限公司；β-巰基乙醇、溶菌酶、考馬斯亮藍R250購自北京北方同正生物技術發展有限公司；TEMED購自Promega公司；明膠、大豆油購于新泰裕興生物科技有限公司；Tween-80、卡波姆購自SIGMA-ALDRICH公司；Ag85B特異性抗體購自Abcam公司；HRP-羊抗鼠IgG；凱基BCA蛋白檢測試劑盒購于南京凱基生物科技發展有限公司。

高速冷凍離心機，湘儀離心機儀器有限公司；UV-4802型紫外可見分光光度計，UNIC公司；超聲破碎儀，UIBRA-CELL公司；Hitachi-7650B型電子透射顯微鏡（寧夏醫科大學）。

1.2 方法

1.2.1 重組質粒pET-28a-ag85b的構建 根據文獻[13]的方法和操作步驟構建重組質粒pET-28a-ag85b并對其進行鑒定。

1.2.2 重組質粒pET-28a-ag85b誘導表達 將陽性重組菌株接種于10 mL含有30 μg/mL卡那霉素的LB液體培養基中，37 ℃振蕩培養至OD600 nm值為0.5～0.7時，加入IPTG至終濃度1 mmol/L，37 ℃誘導表達4～5 h，收集菌體。以同樣的方法誘導空載體pET-28a作為對照。

1.2.3 Ag85B重組蛋白SDS-PAGE 和Western blot分析 以pET-28a（+）空載體的轉化菌為空白對照，收集誘導表達過程中的各個樣品，在之后的冰浴超聲破碎離心后，分別收集上清液和包涵體沉淀，上樣于18%聚丙烯酰胺凝膠中進行SDS-PAGE分析，以確定重組蛋白Ag85B 是否正確表達。電泳結束后用半干電轉法將凝膠上的蛋白轉到硝酸纖維素膜上，經5%脫脂奶粉封閉1 h，洗滌后再與1∶1 000稀釋的特異性抗體在4 ℃條件下孵育過夜，洗滌后再與1∶6 000稀釋的HRP-羊抗兔IgG在37 ℃條件下孵育1 h，充分洗滌后，用Western BrightTM ECL試劑盒化學發光曝光顯影。

1.2.4 Ag85B重組蛋白的純化

1）將過濾的鎳柱用Lysis buffer進行平衡，之后加入Ag85B蛋白菌液，室溫下顛倒混勻2 h，混勻后靜置。

2）加入Wash buffer，所滴下的溶液-20 ℃保存備用。

3）重復步驟2。

4）加入Elution buffer，所滴下的溶液-20 ℃保存備用。Elution buffer根據其所含有的咪唑含量的不同分為3種溶液：即Elution buffer （250 mmol/L咪唑）、Elution buffer （500 mmol/L咪唑）、 Elution buffer （1 mol/L咪唑）。

5）將所收集的樣品進行Western blot分析。

1.2.5 納米粒疫苗的制備 根據文獻資料總結，本試驗采用的制備配方為明膠復合佐劑，制備步驟如下[14]：

1）將0.5 mL Tween-80加入6 mL大豆油中攪拌混勻，設為A液。

2）將目的抗原蛋白加入4 mL去離子水中進行混合，之后加入0.35 g卡波姆，1.5 g明膠，攪拌混勻，設為B液。

3）將A液緩緩加入B液中，慢慢滴加，邊滴加邊攪拌，形成的乳液在水浴中超聲處理10～20 min。待明膠乳滴完全膠凝后，再用丙酮稀釋，用220 nm孔徑的濾膜進行過濾，將過濾后的濾液保存于4 ℃備用。

1.2.6 蛋白質含量標準曲線的建立 采用BCA法檢測蛋白質含量，按試劑盒說明書步驟進行操作，并繪制蛋白質含量標準曲線。

1.2.7 載藥率和包封率的測定 將所制備的納米疫苗溶液用PBS緩沖液進行透析處理，分別換液3次，第一次和第二次換緩沖液的時間間隔8 h，最后一次換緩沖液的時間間隔24 h。取已制備好的納米疫苗懸浮液1 mL，用1% HCI破壞微球，蒸餾水稀釋并定容至15 mL，之后調節pH至中性，按“1.2.6”的方法測定其OD540 nm值，換算得到載藥納米微囊中目的蛋白Ag85B的含量。計算納米粒的包封率和載藥率。計算公式如下：

包封率=納米粒中抗原含量/抗原投入量×100%

載藥率=（溶液中總抗原量-游離抗原量）/總抗原量×100%

1.2.8 穩定性的檢測 將制備好的納米疫苗置4 ℃保存3個月，觀察有無凝結、沉淀。

1.2.9 納米疫苗的表征檢測 取一定量的納米疫苗懸浮液，加入0.9% NaCl溶液分散稀釋40倍。滴至鋪有碳膜的銅網上，濾紙吸干，自然晾干后在透射電子顯微鏡下觀察納米粒的表面形態，測量粒徑。

2 結果與分析

2.1 Ag85B重組蛋白Western blot分析結果

以pET-28a（+）空載體的轉化菌為空白對照，收集誘導表達過程中的各個樣品，以特異性抗體，HRP-羊抗兔IgG為二抗，進行Western blot分析。結果（圖1）表明，誘導后的菌株、誘導后分離出的可溶性蛋白和包涵體蛋白均在33 ku左右出現了特異性陽性條帶，對照組空載體pET-28a在相同位置無相應條帶，表明表達的重組蛋白Ag85B能與抗體發生特異性結合，說明其具有良好的免疫原性。

2.2 Ag85B重組蛋白純化結果

由于重組蛋白Ag85B攜帶His標簽，通過與鎳柱相結合，用含有的咪唑含量不同的3種洗脫液溶液（250 mmol/L咪唑、500 mmol/L咪唑、1 mol/L咪唑）分別進行洗脫，進而對洗脫液的濃度篩選出最適的條件，并對每一次所滴下的樣品進行Western blot分析。結果（圖2）表明，誘導后分離出的可溶性蛋白、過柱后的菌液、洗脫液（250 mmol/L咪唑）洗脫下的樣品和洗脫液（500 mmol/L咪唑）洗脫下的樣品均在33 ku左右出現了特異性陽性條帶，而洗液后所收集的樣品和洗脫液（1 mol/L咪唑）洗脫下的樣品在相同位置無相應條帶。綜合分析后認為洗脫液（250 mmol/L咪唑）為最適合的濃度，所洗脫下的重組蛋白Ag85B的表達量明顯高于誘導后分離出的可溶性蛋白。

2.3 納米粒的載藥率及包封率

2.3.1 蛋白質含量標準曲線的建立 按照“1.2.6”的方法，建立蛋白質含量標準曲線。測得的OD540 nm值如表1所示。以OD540 nm值與對應的蛋白質濃度關系線性擬合，得到標準曲線方程為：y=0.011 8 x+ 0.146 4（R2=0.983 3）。結果表明在1～20 μg/μL濃度范圍內，蛋白質濃度與OD540 nm值之間有良好的線性關系（圖3）。

2.3.2 載藥率和包封率的測定結果 初始抗原投入量為200 mg，按照“1.2.7”的方法和公式測定載藥率和包封率，結果見表2。載藥率是衡量載體效率的重要指標，由文獻結果顯示，藥物載體的載藥率一般為60%～85%，包封率一般為17.64%～56.84%[14]。由表2可見，所制備的明膠佐劑的納米疫苗載藥率和包封率的結果與文獻相一致。

2.4 納米疫苗穩定性檢測結果

將所制備的納米疫苗在4 ℃靜置6個月，明膠納米疫苗為乳白色懸乳液，外觀無變化，無沉淀析出，表明其穩定性好。

2.5 納米疫苗顆粒的表征

透射電子顯微鏡下觀察明膠復合佐劑納米疫苗的表面形態，由圖4可見，所制備的明膠復合佐劑納米疫苗顆粒粒徑均一，平均粒徑在100 nm左右。

3 小結與討論

目前，國內外研究較多的結核分枝桿菌免疫優勢抗原蛋白主要有Ag85B復合物、CFP10、ESAT-6和MPB64等。研究發現，在牛分枝桿菌、結核分枝桿菌和BCG培養液中Ag85B含量豐富[15]。Ag85復合物參與菌體細胞壁的合成，對維持菌體的結構起著重要作用[16]。研究表明，Ag85A和Ag85B可誘導特異性Th1型細胞免疫應答、誘導IFN-γ的產生及CTL反應[17]。Horwitz等[18]研究表明，重組Ag85A或者重組Ag85B免疫豚鼠后，可有效地誘導CD8+T細胞免疫應答。研究發現Ag85B刺激健康人體后，外周血單個核細胞（Perpheral blood mononuclear cell， PBMC）有明顯增殖并提高分泌IFN-γ[19]。因此，Ag85B是開發新型抗結核藥物作用的靶位點[20，21]，也是開發新型疫苗的候選抗原。

本研究以明膠為載體材料，輔以卡波姆、Tween-80等佐劑或表面活性劑，采用納米技術制備了明膠佐劑配方的載牛結核分枝桿菌免疫優勢抗原蛋白Ag85B的納米疫苗，對其進行了相關的工藝檢測。結果顯示，所制備的明膠納米疫苗為乳白色懸乳液，穩定性好，4 ℃保存6個月外觀無變化，無沉淀析出。在疫苗中的顆粒通過透射電鏡觀察形態，并測量了粒徑。結果表明，疫苗顆粒粒徑均一，平均粒徑在100 nm左右，載藥率為71.83%，包封率為41.03%，為下一步研究制備成功的納米疫苗免疫原性的相關研究奠定了堅實的基礎。

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