5—Aza—dC及TSA對人胃癌細胞株SGC—7901 Runx3基因甲基化和表達水平的影響解析

摘要：目的 探討5-Aza-dC及TSA對人胃癌細胞株SGC-7901 Runx3基因甲基化和表達水平的影響?方法 對5-Aza-dC及TSA單獨或聯合應用進行體外培養SGC-7901細胞的處理，分別提取細胞蛋白質?RNA和DNA，通過甲基化特異性定量PCR法進行Runx3基因啟動子區甲基化狀態進行檢測?結果 對照組相對表達量與各組相對表達量相比具有明顯的統計學差異（P<0.05），各組蛋白表達水平具有明顯的統計學差異（P<0.05）?結論 5-Aza-dC和TSA兩藥聯合應用具有一定的協調作用，進而改善胃癌治療效果?

關鍵詞：5-Aza-dC；人胃癌細胞株；SGC-7901 Runx3基因甲基化

【中圖分類號】R735.2 【文獻標識碼】A 【文章編號】1672-8602（2015）04-0555-01

胃癌是一種發病率較高的惡性腫瘤，也是導致我國人民死亡的主要病因，該疾病在我國的死亡率和發病率均明顯高出世界平均值?化療藥物治療和手術治療是胃癌患者首選的治療措施，然而，有相當一部分患者確診時已經為晚期，因而手術治療效果較差，化療藥物也僅僅對于部分患者有效，且會導致患者出現一定的不良反應癥狀?醫學研究結果證實，DNA甲基化在胃癌的發生和發展過程中起到了重要作用，因此，抑癌基因異常甲基化狀態的逆轉是一種較為有效的胃癌治療方法?本次醫學研究就對5-Aza-dC及TSA對人胃癌細胞株SGC-7901 Runx3基因甲基化和表達水平的影響進行了分析，現報道如下?

1 資料和方法

1.1 材料

本次醫學研究所用材料包括：北京中杉金橋公司生產的β-Actin一抗?二抗，博奧森生物技術有限公司生產的Runx3兔抗人多克隆抗體，TAKARA公司提供的探針和引物，Fermentas公司生產的dNTP和Taq酶，Promega公司提供的RTPCR試劑盒，Invitrogen公司提供的RNA抽提試劑TRIzol，TAKARA公司提供的Real Time PCR試劑，GEPIGENTEK公司提供的DNA修飾試劑盒，TIANGEN公司提供的DNA提取試劑盒，GIBCO公司提供的RPMI1640培養基和胎牛血清，安徽醫科大學分子生物學實驗室提供的胃癌細胞?

1.2 方法

1.2.1 各組細胞中Runx3基因mRNA的表達

根據TRIzol試劑盒要求對各組細胞RNA進行提取，將其逆轉錄為cDNA，根據反應條件進行5min的95 ℃預變性擴增，分別在95 ℃ 30 s?52 ℃ 30 s?72 ℃中進行35個30 s的擴增循環，后用瓊脂糖凝膠電泳試驗對結果進行驗證，通過Quantity One軟件進行β-Actin基因和Runx3基因條帶灰度值的分析，進行3次相同的實驗，并對各組灰度值比值的mean±SD進行計算，以此作為Runx3 mRNA表達水平的結果?

1.2.2 各組細胞中Runx3基因蛋白的表達

按方法提取各組細胞蛋白，通過BCA蛋白濃度測定試劑盒對蛋白濃度進行測定，調節后的蛋白加上緩沖液煮沸5 min，保證其完全變性，通過15 V恒壓和15%SDS-PAGE凝膠電泳進行30min的半干轉膜，將凝膠上的蛋白置于PVDF膜上?在室溫下用脫脂奶粉50g/L進行PVDF膜的1h封閉，加入一抗稀釋液，在4 ℃環境中過夜孵育，后使用TBST漂洗PVDF膜進行4次8 min漂洗，加入二抗稀釋液，連續1h在37 ℃環境中孵育，最后使用TBST漂洗PVDF膜進行4次8 min漂洗[1]?

1.3 統計學處理

本次醫學研究通過SPSS17.0軟件分析和處理所得數據?計數資料通過X2檢驗方法進行統計學處理，計量資料通過（x±s）方法進行統計學處理和表示，其他數據資料通過單因素方差分析法進行統計學處理，如果所得分析結果P<0.05，可以證實兩組數據資料對比具有明顯的統計學差異[2]?

2 結果

設定對照組甲基化水平為1，則其余各組細胞加藥后，TSA組甲基化水平為0.63，5-Aza-d C組甲基化水平為0.7，TSA+5-Aza-d C組甲基化水平為0.37?各組細胞的Runx3基因的mRNA相對表達量為：對照組（0.14±0.04），5-Aza-d C組（0.29±0.02），TSA組（0.28±0.03），TSA+5-Aza-d C組（0.45±0.02），對照組相對表達量與各組相對表達量相比具有明顯的統計學差異（P<0.05）?各組細胞中Runx3基因蛋白表達情況：對照組（0.09±0.02），TSA組（0.37±0.10），5-Aza-d C組（0.35±0.05），TSA+5-Aza-d C組（0.50±0.09），各組蛋白表達水平具有明顯的統計學差異（P<0.05）?

3 討論

腫瘤學研究結果提出，基因表達遺傳學改變和遺傳基因缺陷是誘發惡性腫瘤的主要原因，缺失和突變等基因缺陷均會對編碼區功能和結構造成破壞，表觀遺傳學會誘導組蛋白乙?；?去乙?；駾NA甲基化等自身化學修飾方式發生一定的改變，進而達到DNA功能調控的作用[3]?mRNA表達水平結果證實，TSA和5-Aza-dC都會導致Runx3基因mRNA表達水平的增加，兩藥聯合應用效果更加顯著，由此可見，Runx3 mRNA啟動子區甲基化水平與其表達水平之間存在直接聯系，5-Aza-dC和TSA會對Runx3基因啟動子區的異常甲基化狀態產生逆轉作用，進而形成Runx3基因的重新表達，并起到Runx3基因重新抑制癌癥基因的效果?Runx3基因蛋白表達水平證實，各加藥組m R NA表達水平越高，則蛋白表達水平也就越高，而這一結果也提高了實驗結果的可靠性，并從蛋白表達水平的角度證實了5-Aza-dC和TSA的藥效以及兩藥聯合的協調作用?

參考文獻

[1] 孟蘭，程敏，沈國棟等.5-氮雜-2-脫氧胞苷和曲古抑菌素A對胃癌MGMT基因表達及NF-kB活性的影響[J].第三軍醫大學學報，2014，36（13）：1370-1371.

[2] 劉林青，胡世蓮，沈干，等.5-氮雜-2-脫氧胞苷及曲古抑菌素A對人胃癌 SGC-7901細胞生長及CHFR基因表達水平的影響[J].中國癌癥雜志，2012，22（8）：573-574.

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