黑色素染色方法及診斷學應用

摘要：黑色素是一種不含鐵而含硫的色素，是一種十分穩定的物質，不溶于水及有機溶劑，但長時間在強堿中則可被溶解，還可被強氧化劑如過氧化氫和高錳酸鉀等脫色，還具有將氨銀液還原為金屬銀的能力，因而，用氨銀液浸染，可使黑色素呈黑色?

關鍵詞：黑色素染色方法；診斷；應用

【中圖分類號】R44 【文獻標識碼】A 【文章編號】1672-8602（2015）05-0171-01

黑色素由起源于神經嵴的黑色素母細胞所產生，并移行到皮膚?眼和中樞神經系統?正常情況下，皮膚的表面?毛囊?眼的虹膜?睫狀體?脈絡膜，腦的軟腦膜?黑質?迷走背核?交感神經節，脊神經節的節細胞等均可有黑色素存在[1]?常用的銀氨液浸染法還作為親銀反應顯示類癌的親銀細胞顆粒?雖然此法大多已被特異的黑色素瘤抗體的免疫組化染色所取代?但常需結合脫色素漂白法的應用?現以對銀氨液浸染法和硫酸亞鐵法操作方法及診斷應用進行分析?

1 染色方法

1.1硫酸亞鐵法

1.1.1試劑配制 硫酸亞鐵水溶液：硫酸亞鐵0.25g，蒸餾水加至100ml攪拌溶解后取其澄清液，過濾后使用?鐵氰化鉀醋酸液：鐵氰化鉀1g，1%冰醋酸加至100ml3.1%冰醋酸水溶液，冰醋酸 1ml，蒸餾水99ml，0.5%中性紅水溶液?

1.1.2操作方法：組織固定10%福爾馬林液，常規脫水?包埋?切片脫蠟至蒸餾水?蒸餾水5～10秒鐘?在硫酸亞鐵水溶液中處理1小時?蒸餾水洗2次，每次1～2分鐘?在鐵氰化鉀醋酸液處理30分鐘?用1%醋酸水溶液洗5～10秒鐘?0.5%中性紅對比染色1～2分鐘?蒸餾水洗5～10秒鐘?0.95%酒精，無水酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固?

1.1.3結果：黑色素呈綠色至墨綠色，細胞核呈紅色

1.2銀氨液浸染法

1.2.1試劑 氫氧化銀氨液：取10%硝酸銀水溶液20mL，逐滴加入濃氨水至產生沉淀后，繼續滴加使沉淀復溶，溶液變清；然后再滴入10%硝酸銀水溶液數滴至溶液稍呈輕微混濁；最后加入蒸餾水20mL，過濾后備用?5%硫代硫酸鈉水溶液?O-2%氯化金水溶液?

1.2.2操作 常規切片脫蠟至蒸餾水?蒸餾水再洗后，入氫氧化銀氨液于室溫暗處作用12-18h?蒸餾水速洗，0.2%氯化金水溶液調色2min?蒸餾水洗后，5%硫代硫酸鈉水溶液定影2-3min?流水沖洗5-10min?用核固紅液復染5-10min，或用蘇木素伊紅復染?水洗后常規脫水?透明?封固?

1.2.3結果：黑色素?親銀顆粒?嗜鉻顆粒?某些脂褐素呈黑色，胞核呈紅色（核固紅復染）或藍灰色（蘇木素復染）?

2操作注意事項

2.1硫酸亞鐵法 不要使用含鉻酸鹽的固定液?硫酸亞鐵與鐵氰化鉀溶液，需現用現配，而且不能保存再用?含鐵血黃色也可呈綠色，加染一張切片做鐵反應來區別?對比染色也可選用Van Gieson染色?

2.2銀氨液浸染法 為防止染色時脫片，可在脫蠟后?無水酒精后，浸0.5%火棉膠3～5分鐘?稍風干后，用80%酒精固定2～3分鐘后入水?染色完畢后在無水酒精脫水后入丙酮液5分鐘將切片中的火棉膠膜脫掉?M.F溶液浸染時間可縮短，但不可延長，如時間過長切片呈黑色，脂褐素?膽色素?嗜鉻細胞顆粒均呈黑色?HE染色黑色素呈棕黃色，要對照HE切片或使用已知的陽性切片作陽性對照染色，鏡下控制觀察黑色素呈黑色為止[2]?如需要可在第五步后用0.2%氯化金調色，也可選用Van Gieson，HE做對比染色?銀氨液的配制?保存及使用中，各環節要求潔凈?避光等，類似網染?脫色素漂白法即酸化高錳酸鉀氧化2-4h后草酸漂白?通常，要證實是否有黑色素存在時，應作連續切片染色：HE染色?黑色素染色?脫色素漂白染色，并使用已知陽性片作陽性對照?對無色素性黑色素瘤，此法不能顯示，需用DOPA反應加以證實[3]?銀氨液浸染時間不宜過長（置37℃溫箱作用1h即可），除黑色素外，親銀顆粒?嗜鉻顆粒?膽色素?某些脂褐素均呈黑色，應注意區別?

3應用

黑色素由黑色素母細胞所產生，它起源于神經嵴，在胚胎發育過程中，由神經嵴移行到皮膚?眼和中樞神經系統?這種細胞含有合成黑色素所必須的酪氨酸酶，在此酶的作用下，將酪氨酸氧化成黑色素?在正常情況下，皮膚的表面?毛囊?眼的虹膜?睫狀體?脈絡膜，腦的軟腦膜?黑質?藍斑?迷走背核?交感神經節，脊神經節的節細胞等均可有黑色素存在?在常規HE切片中，黑色素為顆粒狀，呈棕黃色或棕褐色顆粒，其顆粒大小不一，形狀不一[4]?黑色素是一種不含鐵而含硫的色素，是一種十分穩定的物質，不溶于水及有機溶劑，但長時間在強堿中則可被溶解，還可被強氧化劑如過氧化氫和高錳酸鉀等脫色，還具有將氨銀液還原為金屬銀的能力，因而，用氨銀液浸染，可使黑色素呈黑色?

3.1用于黑色素瘤的診斷 在可疑為黑色素瘤尤其是未分化的腫瘤組織中或淋巴結內的腫瘤細胞中，用黑色素染色，證明有黑色素存在時，往往首先考慮為黑色素腫瘤?此外，色素性神經瘤，透明細胞肉瘤?皮病性淋巴結炎等均有黑色素存在?

3.2用于皮膚病的診斷：如黑色棘皮病?老年疣的皮膚中都有色素沉著，在必要情況下可采用黑色素染色，以利于觀察與診斷?

3.3與含鐵血黃素?脂褐素等其它色素鑒別診斷，需要黑色素染色法進行觀察為診斷提供依據?非色素黑色素瘤用上述一?二?三種方法不能顯示，可用多巴氧化酶反應加以證明?

參考文獻

[1] 張哲，陳輝.實用病理組織染色技術[M].沈陽：遼寧科學技術出版社，1987.162-163.

[2] 李桂萍；李瑞；杜雪玲.植物DNA的Feulgen染色法研究[J]；安徽農學通報（上半月刊）；2012.18（13）：44-46.

[3] 唐從國，王金生.黑色素的來源 形成機制在病理技術中的應用[J].實用醫技雜志.2011.18（9）：943-944.

[4] 曲利明，楊凱，龔曉瑾.不同顯色方法在黑色素瘤中的應用比較[J]. 農墾醫學.2012.34（3）： 234-235