海風藤正丁醇提取物抗類風濕作用藥效學研究

秦 晴，闕金花，張玉琴，李 煌，徐 偉，褚克丹

(福建中醫藥大學 藥學院，福建 福州 350122)

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海風藤正丁醇提取物抗類風濕作用藥效學研究

秦 晴，闕金花，張玉琴，李 煌，徐 偉，褚克丹*

(福建中醫藥大學 藥學院，福建 福州 350122)

目的：研究海風藤正丁醇提取物的抗類風濕活性。方法：采用熱板法、棉球肉芽法、耳腫脹法等建立炎癥和疼痛模型，觀察海風藤正丁醇提取物對大鼠、小鼠的抗炎鎮痛作用。結果：海風藤正丁醇提取物各劑量組均表現出較好的抗炎鎮痛效果，且抗炎作用強于鎮痛作用。結論：海風藤正丁醇提取物具有較好的抗炎鎮痛作用，可作為抗類風濕關節炎的潛在開發藥物。

海風藤；抗炎鎮痛；類風濕關節炎

海風藤為胡椒科植物風藤(Piperkadsura(Choisy) Owchi.)的干燥藤莖，具有祛風濕、通經絡、止痹痛的功效，用于風寒濕痹、肢節疼痛、筋脈拘攣、屈伸不利等癥的治療[1]。該藥最早記載于清代葉天士的《本草再新》，謂“海風藤行經絡、和血脈、寬中理氣、下濕祛風”，在民間亦廣泛用于風濕痹證的治療。海風藤的主要化學成分為胡椒堿類生物堿、木脂素、揮發油，次要化學成分為黃酮和脂肪酸類化合物[2-3]。

查閱總結相關文獻可知，海風藤的藥理作用研究主要集中在腦損傷保護方面[4-6]，對其抗風濕作用研究較少，僅有少數學者對其提取物進行了抗炎作用研究[7-8]。類風濕關節炎的臨床表現為關節腫脹、疼痛，炎癥和疼痛是其兩大主要癥狀，因此臨床治療以抗炎、鎮痛為主。本研究采用熱板法、棉球肉芽法、耳腫脹法等建立炎癥和疼痛模型，觀察海風藤正丁醇提取物對大鼠的抗炎鎮痛作用，為今后進一步開發利用提供科學依據。

1 儀器與材料

1.1 動物

SPF級Wistar大鼠，6周齡，體重(180±20)g，雄性；KM小鼠，4周齡，體重(20±2)g，雌雄各半，均由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，實驗動物合格證號：SCXX(滬)2008-0005。福建中醫藥大學實驗動物中心提供SPF級醫學實驗動物環境設施，使用許可證號：SYXK(閩)2009-0001。

1.2 儀器與設備

YLS-Q4耳腫脹打耳器(淮北正華生物儀器設備有限公司)；SE202F型電子天平(奧豪斯儀器(上海)有限公司)；YLS-7B型足趾容積測量儀(山東省醫學科學院設備站)；YLS-6A型智能熱板儀(山東省醫學科學院設備站)；OS200-PH型光學顯微鏡(重慶奧特光學儀器有限責任公司)；HH-4數顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)；TGL-5-A臺式水平離心機(上海安亭科學器材公司)；MILLI-Q超純水裝置(美國MILIPORE公司)；ELX80O酶標儀(美國BIO-Tek公司)；101C-3電熱鼓風干燥箱(上海實驗儀器總廠)。

1.3 藥物與試劑

海風藤：福州回春中藥飲片廠有限公司，批號：130928；阿司匹林片：浙江醫藥股份有限公司，批號：185501；消炎痛：臨汾奇林藥業有限公司，批號：1009041；地塞米松：浙江仙琚制藥有限公司，批號：131189；二甲苯：國藥集團化學試劑有限公司，批號：F20050608；角叉菜膠：美國Sigma公司，批號：073K0052；冰醋酸：南京化學試劑廠，批號：08260。

2 方法

2.1 藥物制備

取海風藤7kg，用70%乙醇回流提取3次，每次1.5h，合并提取液，得到乙醇提取物。旋轉蒸發回收乙醇，浸膏加水混懸后，依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、水飽和正丁醇萃取，回收溶劑后蒸干得到正丁醇部分377.37g，分別用0.5% CMC-Na溶液配成7.72mg/kg(低)、15.44mg/kg(中)、30.88mg/kg(高)的海風藤提取液。

2.2 二甲苯所致小鼠耳腫脹模型[9-10]

將50只KM小鼠隨機分為五組，分別為模型對照組、陽性對照組(地塞米松)、海風藤正丁醇提取物高、中、低劑量組。各實驗組小鼠每天按設定劑量連續灌胃給藥1周，每天1次，模型對照組小鼠給予等量溶媒。

末次給藥后30min于每只小鼠左耳兩面涂抹適量(0.05mL)純二甲苯，以右耳為對照，建立炎癥小鼠模型。1h后，將小鼠頸椎脫臼處死，沿耳廓基線取下兩耳，用打孔器分別在兩耳同一部位取下圓耳片，分別稱重，以左右耳片重量之差作為耳廓腫脹度，評價藥物的抗炎效應，并計算其抑制率。耳廓腫脹抑制率=(左耳重量-右耳重量)/左耳重量×100%。

2.3 棉球所致大鼠肉芽腫模型[9-10]

取大鼠50只，體重180～220g，雄性，隨機分為五組，每組10只，分別為模型對照組、陽性對照組(地塞米松)、海風藤正丁醇提取物高、中、低劑量組。實驗前所有大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(30mg/kg)麻醉，背部剃毛。采用手術法于大鼠背部皮下植入已消毒稱重的棉球，縫合皮膚，外部消毒。于手術當日開始給藥，各實驗組大鼠每天按設定劑量連續灌胃給藥1周，每天1次，模型對照組大鼠給予等量溶媒。于末次給藥后處死大鼠，取出植入的棉球，仔細剝離附著組織，放置烘箱60℃烘干，稱重，減去原棉球重，即為肉芽組織重量，計算抑制率。抑制率=(給藥組肉芽腫重量-模型對照組肉芽腫重量)/模型對照組肉芽腫重量×100%。

2.4 角叉菜膠所致大鼠足腫脹模型[9-10]

取大鼠60只，隨機均分為六組，分別為空白對照組、模型對照組、陽性對照組(消炎痛)和海風藤正丁醇提取物高、中、低劑量組，各實驗組大鼠每天按設定劑量連續灌胃給藥14天，空白對照組、模型對照組大鼠給予等量溶媒。

末次給藥后1h于大鼠右后足踝關節處作標記，按足容積法測定2次，取平均值作為給藥前正常足容積(mL)。然后將1%角叉菜膠生理鹽水0.1mL注入大鼠左后肢足趾皮下制造炎癥模型，分別于注入后l、2、4、6h測定大鼠足容積，以足腫脹度評價海風藤提取物的抗炎效應。

2.5 熱刺激所致小鼠疼痛反應模型[9-10]

實驗前，將小鼠置于熱板儀(55.0±0.5℃)上，立刻計時，記錄小鼠從置于熱板上到出現舔后足現象的時間(s)，作為小鼠的正常痛閾值。凡舔后足時間小于5s或大于30s以及跳躍不安者，均棄之不用。

取小鼠50只，雌雄各半，隨機分為空白組、陽性對照組(消炎痛)、海風藤正丁醇提取物高、中、低劑量組，各實驗組小鼠每天按設定劑量連續灌胃給藥14天，每天1次，空白組小鼠給予等體積溶媒。末次給藥lh后將各組小鼠分別放入熱板儀內，以舔后足作為疼痛反應的指標，記錄小鼠自投入熱板至出現舔后足反應的時間。60s內無反應的小鼠應立即取出，以免燙傷，其痛閾值按60s計算，以痛閾值評價海風藤提取物的鎮痛作用。

2.6 醋酸所致小鼠扭體反應模型[9-10]

取小鼠50只，雌雄各半，隨機分為模型組、陽性對照組(阿司匹林)、海風藤正丁醇提取物高、中、低劑量組，各實驗組小鼠每天按設定劑量連續灌胃給藥3天，每天1次，模型對照組小鼠給予等體積溶媒。末次給藥lh后將0.6%醋酸溶液注射于小鼠腹腔內，以引起深部、大面積而持久的疼痛刺激，致使小鼠產生扭體反應。以小鼠腹部凹陷、雙后肢伸展為扭體反應的指標，觀察各組小鼠出現扭體反應的時間(潛伏期)及15min內扭體反應的次數。

2.7 統計學方法

3 結果

3.1 對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響

涂抹二甲苯后，與右耳比較，小鼠左耳產生明顯腫脹。與模型對照組小鼠比較，各給藥組小鼠左耳腫脹程度均有所減輕，差異具有統計學意義(P<0.01)。表明海風藤正丁醇提取物能明顯抑制二甲苯所致小鼠耳腫脹，抑制率均大于35%，且隨著劑量的增加抑制作用增強。結果見表1。

表1 海風藤正丁醇提取物對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響 (±s)

注：與模型組比較，**P<0.01。

3.2 棉球所致大鼠肉芽腫模型

大鼠背部皮下植入滅菌棉球后可形成慢性肉芽腫，以此模擬慢性炎癥反應。與模型組大鼠比較，中、高劑量組大鼠肉芽腫重量顯著降低，差異具有統計學意義(P<0.01或P<0.05)，且低劑量組也有抑制趨勢，但與模型組大鼠比較差異無統計學意義(P>0.05)。海風藤正丁醇提取物對慢性炎癥有較強抑制作用，且以高劑量組作用最為顯著。詳見表2。

表2 海風藤正丁醇提取物對大鼠棉球肉芽腫的影響 (±s)

注：與空白對照組比較，**P<0.01，*P<0.05。

3.3 對角叉菜膠致大鼠足腫脹的影響

大鼠左后足注射1%角叉菜膠后，足爪出現明顯腫脹。各組大鼠給予相應藥物后，空白對照組、海風藤正丁醇提取物高、中、低劑量組大鼠足腫脹值均低于模型組；高劑量組大鼠致炎后2、4、6h足腫脹值與模型組比較差異具有極顯著性意義(P<0.01)，但中、低劑量組大鼠足腫脹值與模型組比較無統計學差異(P>0.05)，提示高劑量海風藤正丁醇提取物能有效抑制角叉菜膠所致足腫脹。詳見表3。

表3 海風藤正丁醇提取物對角叉菜膠致大鼠足腫脹影響 (±s)

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與空白組比較，##P<0.01。

3.4 對熱刺激所致小鼠疼痛反應的影響

與空白組比較，海風藤正丁醇提取物各劑量組小鼠疼痛反應出現時間均延長，其中高劑量組延長作用最明顯，差異具有統計學意義(P>0.05)。詳見表4。

表4 海風藤正丁醇提取物對熱刺激致小鼠疼痛反應影響 (±s,s)

注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.5 對小鼠化學刺激法疼痛反應的影響

與模型組比較，海風藤正丁醇提取物高、中劑量組小鼠疼痛反應出現時間稍延長，15min內扭體次數明顯減少，差異具有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。說明海風藤正丁醇提取物對化學刺激法引起的小鼠疼痛反應有明顯抑制作用，且作用強度與藥物劑量有一定關系。詳見表5。

表5 海風藤正丁醇提取物對小鼠化學刺激法疼痛反應影響 (±s,s)

注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

4 討論

本研究采用熱板法、棉球肉芽法、耳腫脹法等建立炎癥和疼痛模型，觀察海風藤正丁醇提取物對大鼠、小鼠的抗炎鎮痛作用。從炎癥模型實驗中可以看出，海風藤正丁醇提取物低、中、高劑量都有較好的抗炎效果，但在鎮痛實驗中，低劑量海風藤正丁醇提取物未顯示出明顯鎮痛效果。表明海風藤正丁醇提取物各劑量組均表現出較好的抗炎鎮痛效果，且抗炎作用強于鎮痛作用，為進一步研究其抗風濕活性奠定了基礎。

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(責任編輯：尹晨茹)

2014-10-20

國家自然科學基金項目(81001624)；福建中醫藥大學校管課題(XB2011006)

秦晴(1984-)，福建中醫藥大學碩士研究生，研究方向為中藥制劑及質量標準。

褚克丹(1963-)，女，福建中醫藥大學教授，博士生導師，研究方向為中藥藥劑及質量標準控制。

R285.5

A

1673-2197(2015)04-0013-03

10.11954/ytctyy.201504007