胰腺癌TAK1、p-TAK1的表達及腫瘤相關巨噬細胞的浸潤密度

馬丹 程芳芳 楊帆 滿曉華 高軍 張永鎮 李兆申

·論著·

胰腺癌TAK1、p-TAK1的表達及腫瘤相關巨噬細胞的浸潤密度

馬丹 程芳芳 楊帆 滿曉華 高軍 張永鎮 李兆申

目的檢測胰腺導管腺癌及相應癌旁胰腺組織TGF-β激活激酶1(TAK1)、磷酸化TAK1(p-TAK1)的表達及腫瘤相關巨噬細胞(TAM)的浸潤密度，分析二條途徑之間的相關性及其與腫瘤臨床病理特征的相關性。方法應用免疫組化法檢測57例胰腺癌及35例相應癌旁正常胰腺組織TAK1、p-TAK1及TAM標志物CD68蛋白的表達，計算TAM浸潤密度，采用SPSS18.0軟件分析它們之間及其與臨床病理特征間的關系，采用多因素Logistic回歸分析胰腺癌TNM分期的獨立危險因素。結果胰腺癌組織TAK1、p-TAK1蛋白的陽性表達率分別為42.1%(24/57)和40.4%(23/57)，顯著高于癌旁組織的14.3%(5/35)和11.4%(4/35)；胰腺癌組織CD68陽性的TAM高密度浸潤者占38.6%(22/57)，顯著高于癌旁組織的8.6%(3/35)，差異均有統計學意義(P值均<0.05)。TAK1蛋白表達與胰腺腫瘤的最長徑、分化程度、淋巴結轉移、遠處轉移、臨床分期顯著相關；p-TAK1蛋白表達與腫瘤的分化程度、淋巴結轉移、遠處轉移、臨床分期顯著相關；TAM浸潤密度與腫瘤的分化程度、淋巴結轉移、遠處轉移、臨床分期顯著相關(P值均<0.05)。胰腺癌組織TAK1、p-TAK1表達水平均與TAM的浸潤密度呈正相關(P值均<0.01)。多因素Logistic回歸分析顯示胰腺癌組織TAM高密度浸潤是高等級TNM分期的獨立危險因素(P=0.002，OR=129.5，95%CI6.2～2718.6)。結論TAK1途徑及TAM在胰腺癌的發生和發展過程中具有重要作用，并且兩種機制可能存在一定的協同作用。

胰腺腫瘤； 免疫組織化學； TGF-β激活激酶-1； 腫瘤相關巨噬細胞

絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶(MAPKKK)家族成員TGF-β激活激酶1(TGF-activated kinase 1, TAK1)可以活化NF-κB和激活蛋白-1(AP-1)，是胰腺癌對化療藥物耐受性的重要機制之一，通過基因沉默或抑制TAK1可以逆轉胰腺癌的內在耐藥性[1]。腫瘤相關巨噬細胞(tumorassociated macro-phage，TAM)與胰腺癌血管生成、轉移、免疫抑制、化療抵抗及腫瘤干細胞的生成等密切相關[2]。近年的研究證實，在炎癥刺激的作用下，TAK1的下游靶點之一NF-κB被激活，進而誘導TAM活化，活化的TAM通過直接或間接作用于Hedgehog信號通路誘發和促進胰腺癌的發生，這可能是TAM促進胰腺癌發展的機制之一[3]。本課題組以往的研究初步證實TAK1途徑及Hedgehog信號通路在胰腺癌的發生、發展過程中存在潛在的相互作用[4]，然而關于TAK1途徑與TAM直接相關性的研究較少。本研究進一步檢測胰腺癌組織TAK1、磷酸化TAK1(p-TAK1)及TAM標志物CD68蛋白的表達，分析兩條途徑之間的潛在聯系及其與臨床病理特征的相關性，探討它們在胰腺癌發病中的作用。

材料與方法

一、標本來源

本研究共收集2010年2月7日至2012年9月11日間第二軍醫大學附屬長海醫院胰腺外科接受手術治療的57例患者，獲得每位患者的胰腺癌組織及其中35例配對的癌旁組織標本。所有病例均經病理確診為胰腺導管腺癌。57例患者中男性28例，女性29例，年齡32～82歲，平均(58±11)歲。按2009年UICC(國際抗癌聯盟)制定的TNM分期，Ⅰ期35例，Ⅱ～Ⅳ期22例。所有患者術前均未行化療、放療或其他輔助治療。

二、TAK1、p-TAK1、CD68蛋白檢測

采用免疫組化EnVision染色法(二步法)檢測TAK1、p-TAK1及CD68蛋白的表達，以PBS代替一抗作為陰性對照，已知表達陽性的胰腺癌組織作為陽性對照。兔抗人TAK1及p-TAK1多抗、鼠抗人CD68單抗均購自Abcam公司。由2位病理科專家采用雙盲法進行讀片，兩者讀片結果差異<20%時，取均值；差異≥20%時則再次判讀，直至意見統一。胞核和胞質出現棕黃色或棕褐色顆粒為陽性。TAK1、p-TAK1蛋白表達根據陽性細胞占總細胞數的百分比以及陽性細胞染色強度判定。陽性細胞數≤5%為0分，>5%～≤25%為1分，>25%～≤50%為2分，>50%為3分；細胞無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩分值相乘，0～2分為陰性表達，3～9分為陽性表達。TAM浸潤密度是在200倍光鏡下隨機觀察10個癌組織區域，計算每個區域內CD68陽性的TAM數，取均值。以所有胰腺癌的TAM浸潤密度的中位數作為分界點，將TAM浸潤密度分為低密度組和高密度組[5]。

三、統計學處理

采用SPSS18.0軟件進行統計分析。癌與癌旁正常組織TAK1、p-TAK1表達及TAM密度的差異采用χ2檢驗；胰腺癌TAK1、p-TAK1表達與TAM密度間的相關性及三者與臨床病理特征的相關性采用Fisher精確概率法分析。采用Logistic回歸分析胰腺癌TNM分期的獨立危險因素。P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、胰腺癌和癌旁組織TAK1、p-TAK1蛋白的表達及TAM的浸潤情況

TAK1及p-TAK1陽性表達于癌細胞的胞核和胞質，癌周炎性細胞亦有不同程度的表達(圖1、2)。胰腺癌組織TAK1及p-TAK1陽性表達率分別為42.1%(24/57)和40.4%(23/57)；癌旁組織TAK1及p-TAK1陽性表達于胰腺導管、腺泡和胰島，陽性表達率分別為14.3%(5/35)和11.4%(4/35)，顯著低于胰腺癌組織，差異有統計學意義(χ2分別為7.775、8.748，P值均<0.01)。

圖1 胰腺癌(1A)和癌旁組織(1B)TAK1的表達(免疫組化 ×200)

圖2 胰腺癌(2A)和癌旁組織(2B)p-TAK1的表達(免疫組化 ×200)

CD68陽性表達于TAM的胞核和胞質。TAM主要聚集在腫瘤細胞和癌巢的周圍及腫瘤侵襲的邊緣(圖3)。以所有胰腺癌組織TAM浸潤密度中位數(每個高倍鏡視野30個)為界，38.6%(22/57)的胰腺癌組織TAM浸潤高密度組22例(38.6%)，明顯高于癌旁胰腺組織的8.6%(3/35)，差異有統計學意義(χ2=9.878，P=0.002)。

圖3 胰腺癌(3A)和癌旁組織(3B)的CD68表達(免疫組化 ×200)

二、胰腺癌組織TAK1及p-TAK1表達、TAM浸潤密度與腫瘤臨床病理特征的關系

TAK1表達與腫瘤最長徑、分化程度、淋巴結轉移、遠處轉移、臨床分期密切相關；p-TAK1的表達與腫瘤分化程度、淋巴結轉移、遠處轉移、臨床分期顯著相關；TAM浸潤密度與腫瘤分化程度、淋巴結轉移、遠處轉移、臨床分期顯著相關(表1)。

表1 胰腺癌組織中TAK1、p-TAK1蛋白表達及TAM浸潤密度與臨床病理特征的關系

三、胰腺癌組織TAK1、p-TAK1表達水平與TAM浸潤密度的相關性

胰腺癌TAK1及p-TAK1的表達水平呈正相關(r=0.892，P<0.001)，且均與TAM浸潤密度呈正相關(r值分別為0.857、0.817，P值均<0.001)。

四、胰腺癌TNM分期的相關變量

單因素分析提示，胰腺癌TNM分期與患者年齡、性別及腫瘤部位均無關，但與腫瘤最長徑、分化程度、癌組織TAK1及p-TAK1表達水平、TAM浸潤密度呈正相關(r值分別為0.280、0.303、0.857、0.817、0.926，P值分別為0.034、0.022、<0.001、<0.001、<0.001)。多因素Logistic回歸分析結果顯示，TAM高密度浸潤是高等級TNM分期的獨立危險因素(P=0.002，OR=129.5，95%CI6.2～2718.6)。

討 論

豐富的腫瘤間質是胰腺癌的典型特征之一。胰腺癌間質成分包含浸潤的免疫細胞、星狀細胞、血管、成纖維細胞及細胞外基質等，參與腫瘤微環境的構成。TAK1最初因可被TGF-β信號迅速激活而得名[7]，它是炎癥、免疫、應激反應及腫瘤發生過程中調控信號轉導的關鍵因子。TAM是最主要的免疫群體，可以接收腫瘤微環境中多種細胞分泌的信號分子，通過調控腫瘤血管生成、腫瘤細胞存活、增殖、侵襲、轉移促進腫瘤的發生、發展[2,7]。文獻報道，TAK1與乳腺癌、結直腸癌、淋巴瘤等的發生和發展密切相關[8-10]；TAK1與胰腺癌的化療耐受性有關[11]；胰腺癌組織TAM高密度浸潤與患者預后較差密切相關[5]。

本研究結果顯示，胰腺癌高表達TAK1及p-TAK1，它們的表達與胰腺癌的分化程度、淋巴結轉移、遠處轉移、臨床分期顯著相關，進一步證實TAK1途徑在胰腺癌發生和發展中的重要作用。本研究結果也顯示胰腺癌組織的TAM浸潤密度明顯高于癌旁正常組織，且TAM浸潤密度與腫瘤分化程度、淋巴結轉移、遠處轉移、臨床分期顯著相關，TAM高密度浸潤是高等級TNM分期的獨立危險因素，提示TAM浸潤密度也與胰腺癌的發生和發展有關。

TAK1通過多種形式參與NF-κB的活化，激活的NF-κB又誘導TAM活化，再進一步激活Hedge-hog信號通路，提示胰腺癌的TAK1通路、TAM浸潤及Hedgehog信號通路之間可能存在潛在的相互聯系。本研究結果顯示，胰腺癌的TAM浸潤密度與TAK1、p-TAK1的表達水平呈顯著的正相關，證實TAM與TAK1途徑在胰腺癌的發展過程中存在協同作用，進一步驗證了胰腺癌的發生和發展與炎癥免疫反應相輔相成的關系。

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(本文編輯：屠振興)

Expression of TAK1, pTAK1 proteins and density of tumor associated macrophages in pancreatic carcinoma

MaDan,ChengFangfang,YangFan,ManXiaohua,GaoJun,ZhangYongzhen,LiZhaoshen.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

LiZhaoshen,Email:Iizhaoshen111@yahoo.com.cn

Objective To investigate the expression of TGF-β activated kinase1 (TAK1), phosphoryted TAK1(p- TAK1) and the density of tumor associated macrophages(TAM) in human pancreatic carcinoma tissues and pairing adjacent normal pancreatic tissues, and explore their relationship. Methods The expression of TAK1, p-TAK1, CD68(the marker of tumor associated macrophages) proteins in 57 samples of pancreatic cancer tissues and 35 samples of pairing adjacent normal pancreatic tissues were detected by immunohistochemical method, then the density of TAM was evaluated. The relationship between the protein expression and TAM, and the relationship between them and clinicopathologic parameters were examined using SPSS 18.0 software, and the independent risk factors of TNM staging were analyzed by multivariate logistic regression. Results TAK1 and p-TAK1 were positively expressed in 42.1%(24/57) and 40.4%(23/57) pancreatic carcinoma tissues, significantly higher than adjacent normal pancreatic tissues [14.3%(5/35) and 11.4%(4/35)]; the proportion of pancreatic carcinoma tissues with high density TAM was 38.6%(22/57), higher than that of adjacent pancreatic tissues [8.6%(3/35)], the differences were statistically significant(P<0.05). TAK1 expression was positively related to tumor size, tumor differentiation, lymph node metastasis, distant metastasis and clinical staging; p-TAK1 expression was positively related to tumor differentiation, lymph node metastasis, distant metastasis and clinical staging; the density of TAM was positively related tumor differentiation, lymph node metastasis, distant metastasis and clinical staging (all thePvalues were less than 0.05). The expression of TAK1 and p-TAK1were positively correlated with the density of TAM(P<0.001). Multivariate logistic regression analysis showed that high density of TAM was independently associated with advanced clinical staging (P=0.002,OR=129.5, 95%CI6.2～2718.6). Conclusions TAK1 pathway and TAM may play an important role in the pathogenesis and progression of pancreatic cancer, and there may be synergy effect between them.

Pancreatic neoplasm; Immunohistochemistry; TGF-β activated kinase-1; Tumour associated macrophage

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2015.03.006

上海市重中之重臨床醫學中心建設計劃

200433 上海，第二軍醫大學長海醫院消化內科

李兆申：Email: Iizhaoshen111@yahoo.com.cn

2014-09-11)